目的:　　建立METH中毒的体内外模型，初步探讨α-Syn在泛素蛋白酶体途径中降解障碍而引起神经元损伤中的作用。利用分子生物学技术、细胞生物学技术、神经生物学技术等，通过α-Syn及其丝氨酸129位点磷酸化水平pS129α-Syn、PLK2、CD3δ、Caspase-3、PARP及Parkin等指标的检测，从而研究METH诱导的氧化应激对神经元的损伤作用。再通过SH-SY5Y细胞Parkin过表达慢病毒转染实验及C57小鼠纹状体立体定位技术进一步明确Parkin在α-Syn异常表达中所起的作用，以及METH、Parkin和α-Syn这三者之间的联系，为METH在神经系统损伤机制研究中提供新的靶点。　　方法:　　1.蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞　　用含10％新生胎牛血清(FBS)的DMEM-F12培养基接种SH-SY5Y细胞至6cm培养皿或6孔板中，于37℃和5％CO2条件的温箱中培养，待6孔板中细胞长至70％～80％汇合时，分别用含0mmol/L、DMSO、50nmol/L、75nmol/L、100nmol/L、150nmol/L MG132的2％血清培养基培养24小时，收集细胞并提取蛋白进行检测:Western Blot法检测α-Syn;免疫共沉淀(CO-IP)方法检测α-Syn的泛素化情况。　　2.METH中毒细胞模型的建立　　按照上述方法培养细胞，待6孔板中细胞长至70％～80％汇合时，分别用含0mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L、2.5mmol/L、3.0mmol/L METH的2％血清培养基培养24小时或用2.0mmol/L METH的2％血清培养基分别培养0小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时。收集细胞或提取细胞总蛋白进行以下各项实验:　　(1)Western Blot法检测α-Syn及其磷酸化水平pS129α-Syn、PLK2、蛋白酶体活性标志分子CD3δ、凋亡相关蛋白Caspase-3、PARP及Parkin等指标。　　(2)免疫荧光法检测α-Syn及Parkin表达变化，并采用共聚焦显微镜观察细胞内α-Syn及Parkin表达变化。　　(3)免疫共沉淀(CO-IP)方法检测α-Syn及Parkin的相互作用关系。　　3.METH亚急性中毒动物模型的建立　　4.探究Parkin在METH诱导的α-Syn及其磷酸化异常聚集及其神经毒性的作用　　(1)针对Parkin基因设计并合成人源重组基因病毒，采用转染技术处理SH-SY5Y细胞，实验分为LV-NC组、LV-Parkin组、LV-NC+METH组和LV-Parkin+METH组。Western Blot法检测Parkin蛋白过表达效率及α-Syn、pS129α-Syn、PLK2、蛋白酶体活性标志分子CD3δ、凋亡相关蛋白Caspase-3、PARP等指标表达情况。　　(2)将40只6周龄雄性C57小鼠随机分成4组（n=10只/组）:①空载对照组（LV-NC组）;②过表达组（LV-Parkin组）;⑨空载+METH组(LV-NC+METH组);④过表达+METH组（LV-Parkin+METH组）。使用前期合成并鉴定有效的鼠源Parkin基因重组病毒。利用脑立体定位注射技术向C57小鼠纹状体区注射空载病毒或Parkin基因重组病毒。注射后继续饲养二周，对③空载+METH组和④过表达+METH组给予腹腔注射15mg/kg METH，每间隔12h注射一次，共8次。对①空载对照组和②过表达组小鼠腹腔注射等量生理盐水。最后一次注射METH2h后麻醉、断颈、提取并分离脑组织;Western Blot方法检测Parkin蛋白过表达效率及α-Syn、pS129α-Syn、PLK2、蛋白酶体活性标志分子CD3δ、凋亡相关蛋白Caspase-3、PARP等指标表达情况。　　结果:　　1.蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞　　以SH-SY5Y细胞为体外实验模型，用不同浓度梯度（0nM-125nM）的泛素蛋白酶体抑制剂MG132作用于SH-SY5Y细胞24h。Western Blot结果显示，随着MG132作用浓度的增加，α-Syn表达水平呈显著上升趋势(P＜0.05);免疫共沉淀结果显示，α-Syn泛素化水平呈显著上升趋势(P＜0.05)。结果说明泛素蛋白酶体途径是α-Syn降解的主要途径之一。　　2.METH中毒细胞模型的建立　　(1)用不同浓度梯度(0mM-3.0mM)和时间梯度(0h-24h)METH作用于SH-SY5Y细胞，Western Blot结果显示，随着METH作用浓度和时间的增加，α-Syn表达水平呈上升趋势(P＜0.05)，而E3泛素连接酶Parkin表达水平呈现下降趋势(P＜0.05)。α-Syn磷酸化水平pS129α-Syn水平升高(P＜0.05);蛋白酶体活性标志分子CD3δ升高(P＜0.05);同时凋亡相关蛋白Caspase-3、PARP等表达升高(P＜0.05)。当METH浓度为2.0mmol/L时，α-Syn升高显著(p＜0.01)，因此在后续试验中，选取2.0mmol/L浓度的METH建立中毒细胞模型。以上结果说明，随着METH作用浓度和时间的增加，α-Syn磷酸化修饰增强，蛋白酶体活性降低，这可能导致α-Syn及α-Syn磷酸化蛋白不能被蛋白酶体有效降解而堆积，又进一步增强了METH促进细胞凋亡的作用。　　(2)免疫荧光结果和Western Blot结果相一致，2.0mM的METH作用于SH-SY5Y细胞α-Syn表达水平呈显著上升趋势(P＜0.05),E3泛素连接酶Parkin表达水平呈下降趋势(p＜0.05)。　　(3)免疫共沉淀结果显示，E3泛素连接酶Parkin和α-Syn存在相互作用。　　3.METH亚急性中毒动物模型的建立　　建立C57小鼠METH亚急性中毒模型，实验分为对照组(Ctrl)和亚急性METH组(Subacute)，取纹状体和中脑区进行后续实验。结果发现，亚急性METH组与对照组相比，E3泛素连接酶Parkin表达降低，α-Syn及其磷酸化水平pS129α-Syn、PLK2水平显著升高，蛋白酶体活性标志分子CD3δ呈升高趋势，且凋亡相关蛋白Caspase-3、PARP也呈现升高趋势(P＜0.05)。说明METH注射入C57小鼠后，会导致小鼠脑组织中α-Syn水平增加，α-Syn磷酸化作用增强，同时蛋白酶体活性降低，进一步证明METH作用降低了α-Syn在泛素蛋白酶体途径的有效降解，增加了细胞的凋亡。　　4.探究Parkin在METH诱导的α-Syn异常聚集及其神经毒性的作用　　(1)在SH-SY5Y细胞中转染Parkin基因重组病毒再用METH处理细胞24h，实验分为LV-NC组、LV-Parkin组、LV-NC+METH组和LV-Parkin+METH组。Western Blot结果显示，SH-SY5Y细胞中转染Parkin基因重组病毒后，Parkin蛋白显著增多(P＜0.05)。LV-Parkin+METH组和LV-NC+METH相比，α-Syn表达水平明显下降，且PLK2及α-Syn磷酸化水平也明显下降，凋亡相关蛋白Caspase-3、PARP也有降低，同时蛋白酶体活性标志分子CD3δ降低(P＜0.05)。结果说明Parkin蛋白表达量上升能够缓解METH导致的α-Syn表达量上升，调节α-Syn磷酸化作用，激活蛋白酶体的活性，同时缓解细胞凋亡。　　(2)利用脑立体定位注射技术向C57小鼠纹状体区注射空载病毒或Parkin基因重组病，取纹状体和中脑区进行后续实验。Western Blot结果显示，C57小鼠纹状体区注射Parkin基因重组病后，纹状体和中脑区Parkin蛋白都显著增多(P＜0.05)。LV-Parkin+METH组和LV-NC+METH相比，纹状体和中脑区α-Syn表达水平明显下降，且PLK2及α-Syn磷酸化水平也明显下降，凋亡相关蛋白Caspase-3、PARP也有降低，同时蛋白酶体活性标志分子CD3δ降低(P＜0.05)。结果说明，在体内实验中Parkin蛋白表达量上升也能够缓解METH导致的α-Syn表达量上升，调节α-Syn磷酸化作用，激活蛋白酶体的活性同时缓解细胞凋亡。　　结论:　　1.蛋白酶体抑制剂MG132引起SH-SY5Y细胞内α-Syn表达水平上升，且α-Syn泛素化修饰形式堆积，其上调趋势随着METH浓度的增多而升高。　　2.在METH中毒的体内外模型中，SH-SY5Y细胞及C57小鼠脑组织α-Syn表达量异常增多，pS129α-Syn表达上调，PLK2水平升高，CD3δ表达升高，凋亡升高。　　3.在SH-SY5Y细胞中转染Parkin过表达慢病毒或在C57小鼠纹状体区注射Parkin重组病毒，α-Syn表达下降，PLK2及α-Syn磷酸化水平下降，CD3δ表达降低，凋亡降低。