研究背景幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）是一种定植于人胃部的革兰氏阴性螺旋状杆菌,目前全世界一半以上的人口感染或携带有此细菌。持续的H.pylori感染可引起多种胃部疾病,如慢性胃炎、胃溃疡,更严重的是,它是胃腺癌的重要致癌因子,会显著提高患胃腺癌的风险。H.pylori感染造成如此严重疾病后果的机制尚还不完全清楚,可能跟多种因子相关。过往研究发现H.pylori毒力因子引起的胃部抑制性免疫微环境使细菌不能被有效清除,而临床慢性胃炎的疾病基础就是细菌在胃粘膜持续的定植造成炎症慢性化。组织蛋白酶C（Cathepsin C,CtsC）又名二肽基肽酶I（Dipeptidyl peptidase I,DPPI）,是一种在溶酶体内具有外半胱氨酸蛋白酶活性的组织蛋白酶,它是调节免疫细胞中多种丝氨酸蛋白酶活化的核心调节酶。被CtsC激活的丝氨酸蛋白酶可以被分泌到局部微环境中发挥促炎作用,所以CtsC在多种炎症性疾病中发挥着重要的炎症调节作用。研究发现,在不同的疾病模型中CtsC的作用不同,去除CtsC,一方面能有效为避免过度炎症提供保护机制,另一方面则失去了清除病原体的能力。目前H.pylori感染的胃粘膜中CtsC的表达及其作用还未见报道,因此,研究CtsC在H.pylori感染中的表达调控及其病理生理作用有助于阐明H.pylori持续感染和相关慢性炎症的机制。研究目的1.研究H.pylori感染对胃粘膜CtsC表达的影响及其表达变化的细胞类型;2.探讨H.pylori感染对胃上皮细胞CtsC表达的调控机制;3.探究CtsC在H.pylori感染微环境中的功能;4.阐明CtsC在H.pylori感染中激活中性粒细胞及发挥宿主防御作用的机制。研究方法1.H.pylori感染对胃粘膜及胃上皮细胞CtsC表达的影响研究收集H.pylori感染患者及未感染者的胃黏膜及外周血标本。¹⁴C呼吸实验、快速尿素酶检查、实时荧光定量PCR（real-time PCR,RT-PCR）16S rDNA检测以及血清H.pylori抗体检测用于确定H.pylori感染。RT-PCR检测cagA,根据检测结果将H.pylori感染标本分为cagA+及cagA-组。H.pylori NCTC 11637菌株（WT H.pylori）和cagA突变的H.pylori NCTC 11637菌株（ΔcagA）用于SPF级C57小鼠灌胃,模拟cagA+及cagA-H.pylori感染,并在指定时间取小鼠胃粘膜组织。分别分离各组人和小鼠的胃粘膜,RT-PCR、免疫组化及Western blot检测CtsC的表达。从未感染者分离的原代胃粘膜用于体外WT H.pylori及ΔcagA刺激实验,RT-PCR、ELISA及蛋白芯片用于分析CtsC的表达和分泌。人和小鼠胃粘膜分别使用CtsC和EpCam（CD326）抗体进行免疫荧光共染。另外,分别用WT H.pylori、ΔcagA及H.pylori 26695在不同细菌浓度及时间点刺激胃上皮细胞系（AGS,GES-1,HGC-27）及人原代胃上皮细胞,RT-PCR检测组织蛋白酶家族各蛋白mRNA表达,而Western blot及ELISA检测CtsC蛋白水平。2.H.pylori感染对胃上皮细胞CtsC表达的调控机制研究利用各种常用的信号通路阻断剂（PP2、U0126、SP600125、SB203580、Wortmannin和AG490）处理AGS细胞后,再经WT H.pylori或ΔcagA刺激,Western blot检测CtsC蛋白水平及各关键信号分子的磷酸化,RT-PCR及ELISA检测CtsC的mRNA及蛋白分泌。双荧光素酶报告基因分析H.pylori刺激后,CtsC启动子区全长及各截短序列的启动子活性变化,以及ΔcagA和各信号通路阻断剂对CtsC启动子活性的影响。通过RT-PCR和ELISA检测H.pylori感染后人和鼠胃粘膜、AGS细胞TGF-β1表达,并对H.pylori感染患者胃粘膜中CtsC和TGF-β1表达进行相关性分析。在加入TGF-β1中和抗体或TGF-β受体阻断剂,或者用ERK阻断剂U0126、STAT3阻断剂AG490预处理的情况下,使用WT H.pylori和TGF-β1单独或协同刺激AGS细胞;或者使用WT H.pylori感染的AGS细胞上清再去刺激AGS细胞,最后通过Western blot检测EKR和STAT3的磷酸化,通过RT-PCR及ELISA分析CtsC的表达及分泌。3.CtsC在H.pylori感染微环境中的功能研究在H.pylori感染患者胃粘膜标本中分析CtsC表达与H.pylori定植的相关性。在H.pylori感染的小鼠模型中每周腹腔注射重组活性CtsC,并在指定时间取胃粘膜组织及外周血。小鼠胃粘膜中H.pylori定植量通过RT-PCR测定16S rDNA来计算确定,以细菌数/ng基因组DNA来表示。收集胃粘膜及外周血细胞进行流式细胞表面分子及pHrodo染色,分析小鼠胃粘膜及外周血各主要免疫细胞的比例,中性粒细胞的活性（CD11b,CD62L）及吞噬细菌的能力（pHrodo）。4.CtsC在H.pylori感染中激活中性粒细胞及发挥宿主防御作用的机制研究通过每周给H.pylori感染小鼠模型腹腔注射Ly6G中和抗体以及fMLP来去除或激活小鼠的中性粒细胞。RT-PCR检测16S rDNA检测来计算小鼠胃中的H.pylori定植量,流式细胞仪确定Ly6G中和抗体去除中性粒细胞的效果。另外,体外分别用活性CtsC或其前体酶原proCtsC刺激新鲜人中性粒细胞;或者用SUMO泛素化抑制剂银杏酸、NF-κB抑制剂BAY11-7082及NEMO siRNA预处理后,再用活性CtsC刺激人中性粒细胞。中性粒细胞的活性（CD11b,CD62L）、吞噬细菌能力（pHrodo）以及活性氧产生（ROS）用流式细胞仪进行检测,而SUMO泛素化及磷酸化的NF-κB通路各信号分子用Western blot进行检测。此外,将人新鲜中性粒细胞用不同浓度的活性CtsC进行刺激,分析中性粒细胞体外杀菌活性的差别。研究结果1.H.pylori感染对胃粘膜及胃上皮细胞CtsC表达的影响研究在H.pylori感染患者的胃粘膜中CtsC表达显著降低,而且在cagA+H.pylori菌株感染较cagA-H.pylori菌株感染降低更明显。动物实验也同样发现cagA+H.pylori感染56天的小鼠胃粘膜中CtsC表达显著降低,而cagA-H.pylori菌株感染的小鼠中下降不明显。CtsC在人和小鼠胃粘膜中均在CD326阳性的上皮细胞中高表达,说明胃上皮细胞是CtsC在胃中的重要来源。H.pylori刺激后,各胃上皮细胞系（AGS,GES-1,HGC-27）及人原代胃上皮细胞CtsC表达均显著下调,且WT H.pylori刺激比ΔcagA刺激下调更明显。而且在AGS细胞中,CtsC表达随WT H.pylori感染细菌量及感染时间增加而降低。同时,使用H.pylori 26695菌株刺激AGS细胞同样也观察到CtsC的表达降低。2.H.pylori感染对胃上皮细胞CtsC表达的调控机制研究WT H.pylori刺激AGS细胞能显著增加ERK及STAT3的磷酸化,而ERK及STAT3信号通路抑制剂可以部分消除WT H.pylori引起的CtsC降低。而且,通过抑制Src来阻断cagA磷酸化,可以引起下游ERK磷酸化的降低及CtsC的升高,但是对STAT3的磷酸化没有影响。此外,WT H.pylor刺激可以引起AGS细胞CtsC启动子活性降低,且显著低于ΔcagA刺激组。通过阻断Src,ERK,STAT3信号通路均能显著恢复由WT H.pylori引起的低CtsC启动子活性。TGF-β1在H.pylori感染的人胃粘膜中表达增加,且与CtsC的表达呈显著负相关。同样,H.pylori感染的小鼠胃粘膜及AGS细胞中TGF-β1表达也显著上调。将TGF-β1和H.pylori共同作用于AGS细胞,发现两者在下调CtsC表达方面有明显的协同作用。抑制ERK及STAT3信号通路同样能消除TGF-β1引起的CtsC表达下调。而且,H.pylori刺激的AGS细胞培养上清也能引起其他AGS细胞CtsC表达下调。用抗体中和TGF-β1,或者化学阻断TGF-β受体都能有效抑制CtsC的下调。3.CtsC在H.pylori感染微环境中的功能研究在人胃粘膜中,CtsC表达与H.pylori的定植量呈负相关。腹腔注射活性CtsC能显著增加中性粒细胞的活性,并降低小鼠胃粘膜的细菌量,但是对外周血及胃粘膜各种免疫细胞的比例没有影响。4.CtsC在H.pylori感染中激活中性粒细胞及发挥宿主防御作用的机制研究通过腹腔注射Ly6G中和抗体消除中性粒细胞能显著增加小鼠胃粘膜H.pylori的定植数量,且Ly6G中和抗体能取消活性CtsC引起的小鼠胃粘膜H.pylori的定植减少;而注射fMLP激活中性粒细胞则发挥抑制小鼠胃粘膜H.pylori的定植的作用。体外CtsC刺激实验结果显示,活性CtsC能激活人中性粒细胞,并促进中性粒细胞NEMO的SUMO泛素化,NF-κB p65的磷酸化。但是,SUMO泛素化抑制剂、NF-κB抑制剂以及NEMO siRNA均能抑制活性CtsC引起的NF-κB信号通路激活及其下游的中性粒细胞活化。体外杀菌实验结果也显示活性CtsC杀灭H.pylori的能力呈中性粒细胞数量和CtsC浓度依赖。结论1.H.pylori感染能诱导胃粘膜及胃上皮细胞中CtsC表达降低;2.H.pylori与TGF-β1协同作用通过Src/ERK及JAK/STAT3信号通路发挥下调胃上皮细胞中CtsC表达的作用;3.活性CtsC激活中性粒细胞并减少H.pylori在胃粘膜的定植;4.活性CtsC通过激活中性粒细胞NF-κB信号通路发挥抗H.pylori的宿主防御作用。意义本文发现了一种慢性胃炎发生发展的新机制。H.pylori通过降低胃上皮细胞CtsC表达,进而抑制中性粒细胞活化及杀灭细菌作用,使H.pylori在胃粘膜持续感染。此结果为解释在慢性胃炎中H.pylori如何逃避中性粒细胞清除提供了新的见解,从而为治疗幽门螺杆菌感染提供了有价值的思路。