研究目的:对海南岛部分地区重要动物宿主(蝙蝠、啮齿动物和家禽等)携带病毒病原体的情况进行调查和监测,为防控海南岛新发传染病和再发传染病提供病毒病原本底数据和技术支持。研究方法:根据海南岛不同地区生态环境的特点,以及重要动物宿主(蝙蝠和啮齿动物等)栖息的情况,选取具有代表性的生态环境作为样本采集地点。通过病毒高通量基因组测序,获得重要动物携带病毒的宏基因组数据,并对病毒宏基因组数据进行生物信息学分析。了解不同生态环境中重要动物宿主携带病毒病原的情况,分析不同生态环境中病毒组的多样性和特点。针对重要的新发病毒进行分离培养,全基因组扩增、遗传进化分析等方面的研究,对有潜在致病风险的病毒开发高效特异的检测方法与技术。研究结果:蝙蝠、啮齿动物和家禽样本采集自海南岛五个县市地区,样本数量约为740份,采集时间为2015年至2016年。根据各物种和采集地点信息进行分组,情况如下:蝙蝠652只(海口火山口HHB组210只,屯昌县TCB组442只),啮齿动物85只(海口市HKS组18只,澄迈县CMS组24只,临高县LGS组24只,黎母山LMS组19只),禽类粪便样本3份(鸡CH组、鸭DU组和鸽PI组)。蝙蝠样本的病毒宏基因组数据结果显示,HHB组和TCB组分别获得34396和241062条病毒测序读长(reads)。经数据库比对和序列注释,HHB组和TCB组的蝙蝠病毒组组成基本相似,包括5个病毒科:浓核病毒科(Densovirinae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、圆环病毒科(Circoviridae)、杆状病毒科(Baculovirida)和肌病毒科(Myoviridae)。其中两组共同注释到的哺乳动物病毒包括:禽疱疹病毒(Gallid herpesvirus)、蝙蝠圆环病毒(Bat circovirus)和隼鸟疱疹病毒(Falconid herpesvirus)。另外,两组都有序列注释到了新发病毒,HHB组中有225条病毒reads注释到了人疱疹病毒7型(Human herpesvirus 7),TCB组中有880条病毒reads注释到了蝙蝠圆环病毒。人疱疹病毒7型属于新发病毒,于1990年首次在人血清中分离出来。蝙蝠圆环病毒于2011年首次在中国云南地区的蝙蝠中分离到了蝙蝠源性圆环病毒。另外,大部分的昆虫病毒reads都注释到:浓核病毒(Densovirus)和杆状病毒(Granulovirus)。啮齿动物样本的病毒宏基因组结果显示,CMS(澄迈)、LGS(临高)和LMS(黎母山)三组样本分别获得了7515、5221和3503条病毒reads,绝大部分的病毒reads都注释到了哺乳动物病毒(CMS:89.15%,6700/7515;LGS:100%,5221/5221;LMS:98.40%,3447/3503),以细小病毒(Parvovirus)为主(CMS:88.01%,6614/7515;LGS:97.43%,5087/5221;LMS:90.43%,3168/3503)。三个地区的细小病毒构成各有差异:CMS组中以Bovine hokovirus和鼠博卡病毒(Rat bocavirus)为主,Bovine hokovirus属于在2008年在香港的牛中首次发现的新发病毒,并且与人细小病毒同源性很高;LGS组中以鼠细小病毒(Mouse parvovirus和Rat minute virus)为主,LMS组中以鼠博卡病毒和猪博卡病毒(Porcine bocavirus)为主。另外在CMS组和LMS组中都发现了人腺病毒(Human adenovirus),在HKS组中发现了一株沙粒病毒。家禽粪便样本的病毒宏基因组数据结果显示,三组样本共获得15707条病毒测序读长(reads),其中A组、B组(duck)和C组(pigoens)分别获得13063条、1370条和862条病毒reads。三组样本的大部分病毒序列都注释到了哺乳动物病毒(A:99.3%,12975/13063;B:95.3%,1306/1370;C:81.1%,706/862),大部分为肠道病毒和呼吸道病毒:腺病毒科(Adenoviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)、呼肠孤病毒(Reoviridae)、圆环病毒科(Circoviridae)、星状病毒科(Astroviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、副粘病毒(Paramyxoviridae)、小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)和小双节RNA病毒(Picobirnaviridae)。其中,A组鸡和B组鸭的粪便病毒组成较为相似,大部分病毒reads都注释到了禽冠状病毒(Avian coronavirus);而C组鸽子的病毒组则与A组鸡B组有比较大的差别,大部分病毒reads大多数注释到了可引起免疫性疾病的圆环病毒。并且,我们注意到有病毒序列注释到轮状病毒A型和甲型流感病毒,在后续的PCR检测中,轮状病毒检测为阳性,流感病毒为阴性,在鸡胚分离培养中流感病毒培养结果也为阴性。基于宏基因组分析数据,海口棚户区来源的褐家鼠病毒组中,有病毒序列注释到了新型沙粒病毒科的温州病毒。经PCR验证,其中一只褐家鼠的PCR检测结果为强阳性,通过基因组扩增和克隆成功获得了该毒株的全基因组序列,并命名为HMU(Hainan Medical University)virus。其全基因组同源进化分析显示,HMU virus与2014年首次发现的褐家鼠源的温州病毒浙江株(Wenzhou Virus,WENV)和不明原因发热病人源的柬埔寨株(Cardomones virus)的同源性分别是92%和82%。HMU virus的完整基因组序列已提交至GenBank,登录号为MF595889.1和MF595888.1。另外,在海口活禽市场鸽子粪便病毒组中发现有轮状病毒A(Rotavirus A,RVA),通过PCR扩增和克隆成功获得了用于轮状病毒主要流行型别的VP4和VP7基因片段,按照国际病毒分类学委员会(The International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)对轮状病毒分类的标准,该RVA海口株的分型和命名确定为RVA/Pigeon-haikou/CHN/2016/G18P[17],与可致狐狸共济失调等神经系统疾病的RVA/Fox-tc/ITA/288356/2011/G18P[17]和鸽源跨越物种屏障感染哺乳动物的PO-13株同源性为分别为92%和85%。该RVA的VP7和VP4基因组序列已提交至GenBank,登录号为MG518479和MG518480。经基因组分析,这两株病毒都对人类具有潜在致病风险,为进一步了解HMU virus和RVA/Pigeon-haikou/CHN/2016/G18P[17]的在动物宿主和人群中的流行情况,为防控和诊断提供有效的检测方法。本研究建立了基于SYBR Green I的温州病毒和轮状病毒A的实时定量荧光PCR的检测方法,本方法特异性和灵敏性良好,最低检测下限为1.0×10~2 copies/μl,可用于相关病原的监测和流调工作。结论:蝙蝠、啮齿动物和家禽是许多病毒的天然宿主,随着人类活动范围不断扩大,这些宿主动物与人类接触的机会也越来越大,人类感染病毒病原的风险也不断增大。因此,开展海南岛重要动物宿主携带病毒的本底调查,对防控海南岛新发、再发病毒传染病的爆发和流行具有重要的公共卫生学意义。本研究利用高通量测序技术和生物信息学分析的调查方法,获得了海南岛部分地区(包括海口、澄迈、屯昌、临高、黎母山)的蝙蝠、啮齿动物和家禽携带病毒的宏基因组本底情况。生物信息学分析结果显示,海口和屯昌地区的蝙蝠分别携带的新发病毒是人疱疹病毒和蝙蝠圆环病毒,为这两种新发病毒在海南的流行情况提供了基础的数据。提示这两个地点附近的人群,有潜在感染和传播疱疹病毒和圆环病毒的风险,为我们下一步蝙蝠病毒的研究工作提供了方向和思路。另外,种类丰富的昆虫病毒在两地的蝙蝠种群中广泛流行,一定程度上反映了两地蝙蝠的生态环境情况。本研究中,屯昌、临高和黎母山地区的啮齿动物病毒组中细小病毒的丰度非常高(>98%),携带细小病毒的啮齿动物可能通过污染水源、食物等方式将病毒传播给人,因此在以上地区的啮齿动物经常出没的区域,特别是在景区和居民区等人口来往频繁的地区,应该密切监测与预防肠道疾病的发生。除了细小病毒,我们还鉴定了一株沙粒病毒HMU virus,为沙粒病毒在亚洲地区的广泛流行提供了证据,为海口防控鼠源沙粒病毒进行了科学预警。为将来深入了解其在全岛的分布流行情况、探究其致病性、科学监测和防控沙粒病毒的爆发流行,提供基础数据和检测技术手段。随着海南岛双创事业的长足发展,岛内对活禽食品安全问题越来越重视。本次研究中,海口活禽市场家禽粪便的病毒组中的哺乳动物病毒种类十分丰富,提示对家禽的养殖和流通的各个环节应该加大病毒携带问题的关注,但本次调查中尚未发现有甲型流感病毒的存在。此外,我们鉴定了一株A型轮状病毒,与可致神经系统疾病的RVA/Fox-tc/ITA/288356/2011/G18P[17]和可以穿过宿主屏障感染哺乳动物的PO-13株同源性很高。这株海口流行株毒株是否也存在中枢神经系统的侵染致病能力,是否存在跨越物种屏障导致哺乳动物致病的能力,这些问题仍有待深入的探索。本研究获得了海南岛部分地区重要动物宿主病毒组的本底基础数据,对不同地区的宿主动物的病毒病原谱进行深入的比较和分析,对两株对人畜共患的新发病毒:HMU virus和RVA/Pigeon-haikou/CHN/2016/G18P[17]进行了深入的基因组学分析和高效的检测技术的开发。为全面了解海南岛重要动物宿主携带病毒的生态情况和防控新发病毒传染性疾病的爆发和流行,提供了科学的数据支撑,为下一步其他重要病毒的验证与鉴定和未来新发传染病研究工作的开展提供了科学的方向和思路。