选题依据：泌乳素（Prolactin，PRL）是由垂体前叶合成和分泌的一种多肽类激素，其经典作用是调节哺乳动物乳腺、卵巢及男性附属生殖器官的生长和分化过程，促进泌乳。除此之外，PRL的免疫调节作用也日益受到关注。研究表明PRL不仅可以调节生理性细胞及体液免疫反应，而且对于病理状态（如自身免疫性疾病）时细胞及体液免疫功能的调节也有十分重要的作用。它的具体作用包括：①参与T细胞分化，调节TH1／TH2平衡向TH1方向偏移；②活化蛋白激酶C和鸟氨酸环化酶；③具有促有丝分裂原的作用，诱导淋巴细胞的IL-12受体表达和各种生长因子相关基因的表达；④通过干扰素调节因子促进干扰素r的表达：⑤刺激自身抗体的产生。淋巴细胞的激活需要双信号系统，第一信号系统为抗原肽MHCⅡ类分子和TCR-CD3组成的复合物，第二信号为共刺激分子，包括CD28／B7（CD80和CD86）分子和CD40／CD40配体（CD154）分子。CD28／B7主要与T细胞活化、增殖及凋亡有关，CD40／CD154主要与B细胞活化、增殖及凋亡有关。系统性红斑狼疮（SLE）是人类自身免疫病的原型，免疫调节异常在其发病中起主导作用，其中包括许多免疫细胞的功能异常。临床研究表明，活动期SLE患者PBMC中CD154的表达明显增加，且与疾病活动性相关。SLE活动期及静止期淋巴细胞上CD28的表达与正常对照组之间差异无显著性，而CD80及CD86的表达水平均明显高于正常对照，且活动组又显著高于静止组，其表达水平与SLEDAI呈正相关。可见共刺激分子CD28／B7和CD40／CD154在系统性红斑狼疮的发生、发展中具有重要的作用。在红斑狼疮模型小鼠，注射PRL加速狼疮小鼠的死亡，而抑制PRL的合成和分泌，则降低小鼠的死亡率。一些临床研究报道SLE患者血清PRL水平升高，且与ANA滴度和临床疾病活动性指标呈正相关，可以推测PRL在红斑狼疮的发病中起重要作用，但其具体的作用机制尚不清楚，是否与共刺激分子的表达有关，这是本研究所要解决的主要问题。研究发现PRL能诱导多样的TCR／CD3复合蛋白快速磷酸化，潜在地影响抗原受体功能，参与细胞活化第一信号过程。目前国内外均未见有PRL在细胞活化第二信号中作用的研究报道，为此我们研究了SLE患者PRL与PBMC表面共刺激分子表达的关系，以期阐明其参与狼疮发病的作用机制。PRL的胞内信号转导途径是近年来的研究热点，目前已经达成共识的是，PRL与PRLR结合形成三聚体后引发以JAK-STAT为主要途径的跨膜信号转导作用，将信息传入细胞核，引起目标基因如干扰素调节因子-1（IRF-1）的转录和表达。IRF-1是一种多功能转录因子基因，属于一个小的转录因子家族，参与多种免疫功能的调节，包括肿瘤抑制、骨髓细胞分化、巨噬细胞激活、抗原提呈、凋亡等，尤其重要的是IRF-1可通过与干扰素（IFN）诱导性基因中顺式作用元件结合而调控Ⅰ型干扰素及其相关基因的表达，而Ⅰ型干扰素及其相关基因的异常表达在SLE的发病中起重要作用。因此本研究对SLE患者中IRF-1基因的表达情况及PRL对其的干预作用也进行了探讨。溴隐亭（BRC）是一种多巴胺2型受体的激动剂，可减少垂体PRL细胞中脱氨核糖核酸和信息核糖核酸的产生，从而抑制垂体PRL细胞的过度分泌，也可抑制外周血循环中PRL的生物活性。目前一些临床研究使用BRC治疗某些自身免疫性疾病，有报道BRC25mg／日可明显减轻SLE病情。SLE患者产后口服BRC可以迅速消除高泌乳素和高雌激素对SLE的负面影响，显著地减少产后SLE病情加重的发生率，而且显著地减少产后1年内激素和免疫抑制剂的用量。我们通过研究BRC对SLE患者PBMC共刺激分子表达的影响，从而探讨其治疗SLE的主要机制。目的：1．检测女性SLE患者血清PRL水平，分析其与SLE疾病活动性、临床表现及实验室指标的关系；2．研究PRL对SLE患者外周血单个核细胞（PBMC）表面共刺激信号分子CD40、CD154、CD28、CD86、CD80表达的影响，从而探讨其参与狼疮发病的机制；3．研究在加入BRC后，SLE患者PBMC表面共刺激信号分子CD40、CD154、CD28、CD86、CD80表达变化，从而证实其治疗SLE的主要机制。4．研究SLE患者中IRF-1基因的表达情况及PRL对其的干预作用。方法：1．应用电化学发光仪检测了30例女性SLE患者与20例健康人在清晨静息状态下的血清PRL水平。2．将样本分以下几组：①高PRL的SLE患者组（N=18）；②正常PRL的SLE患者组（N=12）；③正常对照组（N=20）；④正常PRL的SLE患者组+rhPRL；⑤正常对照组+rhPRL；⑥高PRL的SLE患者组+BRC；⑦正常PRL的SLE患者组+rhPRL+BRC。取十二孔板，使每孔细胞数量达到5×10⁶／ml。根据文献资料得出：rhPRL的最适浓度为10ng／ml，BRC的最适浓度为2ug／ml。3．刺激培养：PBMC分离、培养：按密度梯度离心法分离外周血中的PBMC，步骤如下：（1）在12ml有刻度无菌离心管中，每管加入4mlFicoU淋巴细胞分离液—取肝素抗凝的外周静脉血10ml（包括30例系统性红斑狼疮患者和20例正常对照女性）与等量PBS充分混匀稀释，用巴斯德滴管吸取5ml的抗凝血（抗凝血用等量的PBS稀释）沿管壁缓慢叠加于淋巴细胞分离液上（每样本按4管分离），20℃，2000rpm水平离心20min；（2）用毛细胞吸管插到灰白色层，吸取单个核细胞，置于另一离心管内，加入5倍以上体积的PBS，20℃，1500rpm水平离心10min，洗涤细胞一次，获得研究样品的PBMC。（3）处理后的每组细胞放入37℃、5％CO₂培养箱内培养24h后进行流式细胞检测。4．流式细胞仪检测：取培养细胞每组分为5管，1×10⁶个细胞／管，以PBS洗2次后分5管依次加入抗CD40、CD154、CD28、CD80、CD86单抗各18ul，并另设2管同型对照Mouse IgG1 FITC、Mouse IgG1 PE各18ul，4℃、避光孵育30min，以PBS洗2次后加入300ul 1％多聚甲醛固定待检。上机前先用标准荧光微球调整仪器变异系数在2.0％以内，上机后收集10000个细胞荧光强度以对数放大，测定光闪射数据，计算表达CD40、CD154、CD28、CD80、CD86的细胞数，得出阳性荧光细胞百分率。5．应用逆转录酶-聚合酶链反应（RT-PCR）结合凝胶图象扫描技术检测IRF-1基因的表达情况。以β-actin基因的表达量为对照，将IRF-1扩增产物扫描值与β-actin扩增产物扫描值的比值作为IRF-1基因表达的相对值进行相对定量分析。结果：1．SLE患者血清平均PRL水平明显高于正常对照组，且活动期更为明显。SLE患者血清PRL水平与SLEDAI正相关。2．高PRL的SLE患者肾损害、抗ds-DNA抗体阳性、补体C3、C4下降的发生率明显高于血清PRL正常者，而皮疹、关节炎、浆膜炎及血液系统受累的发生率则无明显差异。3．①高PRL的SLE患者组PBMC表面CD154的表达水平显著高于正常PRL的SLE患者组和正常对照组；而正常PRL的SLE患者与正常对照组间CD154的表达水平无显著差异。②高PRL的SLE患者组、正常PRL的SLE患者组PBMC表面CD86的表达水平均显著高于正常对照组，但高PRL的SLE患者组和正常PRL的SLE患者组CD86的表达水平相比无明显统计学差异。③高PRL的SLE患者组、正常PRL的SLE患者组PBMC表面CD40、CD28、CD80的表达水平和正常对照组相比均无统计学差异。4．①经rhPRL刺激后，正常PRL的SLE患者PBMC上CD154表达水平显著高于刺激前。②而经rhPRL刺激前后，正常对照组CD154表达水平与刺激前无明显差异。5．①高PRL的SLE患者组PBMC加BRC共同培养后CD154表达水平与加BRC前相比无统计学差异。②正常PRL的SLE患者+rhPRL组在加BRC共同培养后，其PBMC表面CD154表达水平与加BRC前相比无统计学差异。6．①30例SLE患者和20例正常对照组均检测到特异性IRF-1和β-actin基因片段，其中SLE患者组IRF-1／β-actin比值为0.89±0.21，其中高PRL的SLE患者为1.06±0.26，正常PRL的SLE患者为0.82±0.21，而正常对照组为0.78±0.18。经统计学分析，SLE患者组IRF-1基因表达的相对值显著高于正常对照组；高PRL的SLE患者组显著高于正常PRL的SLE患者组：而正常PRL的SLE患者组与正常对照组间无显著差异。②经rhPRL刺激后，正常PRL的SLE患者IRF-1基因表达的相对值为0.99±0.22，显著高于rhPRL刺激前。③经rhPRL刺激后，正常对照组IRF-1基因表达的相对值为0.79±0.18，与刺激前相比无显著差异。结论：1．PRL在SLE的发病机制中可能起到一定的作用，其水平升高与病情活动明显相关，可作为判定SLE疾病活动的指标之一。2．PRL可上调SLE患者PBMC表面CD154的表达，从而可以推测PRL在SLE中的免疫调节作用可能是通过与PBMC表面的PRLR结合，PRL-PRLR复合物内在化，增加共刺激信号分子CD154的表达而引发的。3．在SLE中，高PRL与CD86的高表达间无因果关系，表明PRL并非通过CD28／B7这条通路而参与SLE的发病。4．BRC未下调内源性PRL或外源性PRL（rhPRL）所诱导的CD154表达水平，证实了BRC治疗SLE的主要机制可能是抑制垂体分泌PRL，从而降低血清PRL水平以达治疗目的，而对已产生的PRL无拮抗或抑制作用。5．研究证实了SLE中存在IRF-1基因的表达异常。且SLE中高PRL水平可能是导致IRF-1基因异常表达的主要原因之一。6．．在SLE中，PRL在胞外可上调CD154的表达，在胞内通过激活JAK-STAT信号通路而调节IRF-1基因的表达。