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CXCR4是趋化因子CXCL12的特异性受体,CXCL12/CXCR4信号轴在肿瘤细胞的增殖、迁移、血管生成诱导和侵袭性等方面发挥着至关重要的作用。CXCR4是一种很有前途的血液疾病和实体肿瘤的治疗靶点。AMD3100作为一种高度特异和有效的CXCR4拮抗剂,已经被应用于许多与CXCL12/CXCR4信号相关疾病的治疗潜力研究。本实验室前期研究发现AMD3100在与其他药物联合治疗肿瘤时,展现了独特的优势。我们发现AMD3100联合PD-1/PD-L1检查点抑制剂能够增加卵巢癌肿瘤免疫微环境的效应T细胞浸润,减少瘤内Treg并将其诱导转化为辅助性T细胞。AMD3100联合VIC008（具有肿瘤抗原靶向和免疫活化功能的融合蛋白）能够降低间皮瘤小鼠模型中的浸润CD8+T细胞表面的PD-1,延长荷瘤小鼠的生存期。我们使用公共数据进行生物信息学分析发现AMD3100对乳腺癌的调控机制最为复杂,建立在本实验室的前期研究基础上,本研究试图探究AMD3100联合免疫检查点抑制剂对乳腺癌的治疗作用。在联合治疗发现新的现象后,我们重点探讨AMD3100单独治疗时对小鼠乳腺癌免疫微环境的调控作用以及体外探讨AMD3100对乳腺癌和间皮瘤细胞调控的机制。目的:本研究体外采用乳腺癌和间皮瘤细胞系,探讨CXCR4在不同表达水平情况下,AMD3100对肿瘤细胞的生长、迁移、凋亡和细胞周期等细胞表型的调控作用以及探讨其发挥作用的分子机制。体内采用小鼠乳腺癌模型来研究AMD3100联合免疫检查点抑制剂对乳腺癌的生长和荷瘤小鼠生存期的影响以及AMD3100单独治疗时对小鼠乳腺癌和间皮瘤肿瘤生长以及肿瘤免疫微环境的调控作用。本研究旨在探索除了靶向CXCL12/CXCR4信号轴外,AMD3100是否还可以与其他分子或通路相互作用以调控肿瘤的生物学行为。这一研究能够为AMD3100的临床前研究提供新的思路以及为临床使用禁忌或者联合用药提供新的理论依据。方法:1.AMD3100对小鼠乳腺癌和间皮瘤肿瘤生长及生存期的影响,以及使用公共数据分析CXCR4高表达和低表达患者样本的临床特征分布、免疫评分以及预测患者对免疫检查点阻断的响应（1）使用雌性BALB/c小鼠构建乳腺癌原位瘤模型,AMD3100联合抗TIGIT抗体和抗PD-1抗体进行治疗,观察荷瘤小鼠肿瘤生长及生存情况。（2）使用C57BL/6J小鼠构建间皮瘤模型,给予AMD3100单独治疗,采用活体成像技术观察荷瘤小鼠的肿瘤生长以及评估生存情况。（3）采用生物信息学技术分析TCGA数据库中乳腺癌患者的CXCR4表达水平高低与患者预后的关系、CXCR4表达水平高低与肿瘤临床分期及患者存活之间的关系（桑葚图:桑基能量分流图,图中延伸的分支的宽度对应数据流量的大小）、CXCR4高表达组与低表达组患者的临床特征分布情况和免疫评分、AMD3100参与调节各种疾病的得分系数以及预测AMD3100可能参与调控的疾病表型。2.AMD3100对肿瘤细胞多种肿瘤表型的调控作用（1）Cy QUANT法体外验证AMD3100对间皮瘤细胞系40L和AE17增殖的影响,以及利用小干扰RNA敲减CXCR4 m RNA之后,再次检测AMD3100对两种细胞系增殖的影响。（2）克隆形成实验和CCK8实验体外验证AMD3100对乳腺癌细胞系4T1、E0771、MDA-MB-231、MCF7增殖的影响。（3）划痕和Transwell迁移实验验证AMD3100对乳腺癌细胞系4T1、E0771、MDA-MB-231、MCF7迁移能力的影响。（4）流式检测AMD3100对乳腺癌细胞系4T1、E0771、MDA-MB-231、MCF7凋亡（Annexin V-PI或Annexin V-7AAD）和周期（PI）的影响。（5）CXCR4慢病毒感染低表达CXCR4的4T1、E0771、MDA-MB-231三种细胞系,构建稳定表达CXCR4的乳腺癌细胞株,流式鉴定稳转细胞株的CXCR4表达水平。（6）CCK8实验验证高或低CXCL12环境下,AMD3100对稳定表达CXCR4乳腺癌细胞株增殖的影响。另外使用Balixafortide（TFA）（CXCR4的另一种高效阻断剂）作为对照,采用Ed U检测法检测AMD3100对不同乳腺癌细胞增殖的影响。3.AMD3100促进间皮瘤和乳腺癌细胞系增殖的机制研究采用蛋白质免疫印迹（Western blot）技术检测通路蛋白的表达水平。4.AMD3100对小鼠乳腺癌模型肿瘤微环境的调节作用（1）采用6-8w雌性C57BL/6J和雌性BALB/c小鼠构建乳腺癌皮下瘤模型,肿瘤注射3天后进行尾静脉注射给药,每隔一天注射一次,同时测量并记录肿瘤的大小。模型构建28天后,CO2麻醉处死小鼠,取眼球血、肿瘤组织、脾脏以及肿瘤引流淋巴结、肝和肺,拍照并称重,使用Graph Pad Prism 9对数据进行统计分析。（2）流式检测外周血、脾脏、肿瘤引流淋巴结和肿瘤中的CD8+T细胞及其表面的PD-1、TIGIT和TIM3的比例,检测肿瘤微环境中的M1和M2型巨噬细胞以及髓系来源抑制性细胞MDSC的比例。（3）免疫荧光检测肿瘤组织浸润的CD8+T细胞、血管生成情况（CD31）、缺氧情况（HIF-1α）、纤维细胞（αSMA）和Ⅰ型胶原（collagenⅠ）沉积情况。结果:1.在乳腺癌小鼠模型中,AMD3100联合免疫检查点抑制剂（抗TIGIT抗体或抗PD-1抗体）未能抑制肿瘤的生长。AMD3100单独治疗组有轻微促进肿瘤的生长和轻微延长小鼠的生存时间的趋势,但统计结果均无显著性。在40L和AE17两种间皮瘤小鼠模型中,AMD3100组也均出现轻微促进肿瘤的生长和轻微延长小鼠的生存时间的趋势,但统计结果无显著性。生物信息学结果显示CXCR4在乳腺癌患者中的表达高于正常人,但是不能作为独立的预后因素。桑葚图结果显示原发癌的四个分期（T1-4）、CXCR4表达水平的高低以及患者死亡人数三者之间无直接联系。进一步将患者分为CXCR4低表达组和CXCR4高表达组,对比两组样本中的临床特征分布情况（p T分期、p N分期、p TNM分期、肿瘤类型、放疗和治疗的类型）,发现各类临床特征与CXCR4表达高低均无直接联系。免疫细胞浸润评分结果显示CXCR4高表达的患者拥有更强的免疫细胞浸润,同时伴随免疫抑制性分子高表达。TIDE算法预测结果显示CXCR4高表达的患者对免疫检查点阻断有更强的应答。CTD和DGIdb数据库结果显示AMD3100对乳腺癌的调控最为复杂,且其参与调控的表型主要有细胞增殖、迁移、凋亡、上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）等。2.Cy QUANT结果显示AMD3100能够促进间皮瘤细胞系40L和AE17细胞的增殖,并呈现浓度梯度依赖。小干扰RNA敲减40L和AE17细胞的CXCR4m RNA后,AMD3100依旧能够促进其增殖。CCK8结果表明AMD3100能够促进乳腺癌细胞（4T1、E0771、MDA-MB-231、MCF7）的增殖,Transwell和划痕实验表明AMD3100能够抑制乳腺癌细胞的迁移,Annexin V-PI凋亡和周期实验证明AMD3100对四种乳腺癌细胞的凋亡和周期影响不大。荧光定量PCR和流式结果显示与低表达CXCR4的正常乳腺上皮细胞相比,4T1、E0771、MDA-MB-231也均低表达CXCR4,MCF7高表达CXCR4,且AMD3100处理之后,CXCR4的表达无明显变化。流式和荧光结果显示我们成功构建了稳定过表达CXCR4的乳腺癌细胞株。我们采用TFA作为对照,CCK8和Ed U结果显示无论细胞处于高或低CXCL12环境,AMD3100均能够促进4T1-CXCR4和E0771-CXCR4细胞的增殖,TFA组则未促细胞增殖。3.Western Blot结果显示AMD3100能够促进40L和AE17细胞AKT磷酸化,并呈现浓度梯度依赖。在低或高CXCL12环境中,无论CXCR4表达水平如何,AMD3100均能够促进AKT上游抑制性分子PTEN的氧化失活,总PTEN水平不变,同时发现40L不表达CXCR7,AE17高表达CXCR7。另外在高CXCL12环境中,40L细胞实验结果显示:相较于野生型细胞组,AMD3100组和si RAN-CXCR4组的ERK磷酸化水平均降低。而在AE17细胞中,各组的ERK磷酸化水平均未发生变化。在4T1和E0771小鼠乳腺癌细胞实验中,AMD3100能够促进AKT磷酸化,ox-PTEN水平无明显变化。当CXCR4低表达时,AMD3100能够促进4T1细胞PI3K和ERK的磷酸化,当CXCR4高表达时,AMD3100能够抑制PI3K和ERK的磷酸化。4.小鼠体内实验结果显示,当CXCR4低表达时,使用3 mg/kg的AMD3100能够明显促进乳腺癌的生长,同时促进肿瘤发生肺转移和促进肿瘤血管生成。当CXCR4高表达时,AMD3100未明显促进肿瘤的生长,也未观察到肿瘤肺转移现象。流式结果显示AMD3100对各组小鼠模型的外周血、脾脏、淋巴结以及肿瘤中的CD4+T/CD8+T细胞比例影响均不大。当CXCR4高表达时,AMD3100下调肿瘤浸润的MDSC细胞比例并促进促肿瘤的M2型巨噬细胞向抗肿瘤的M1型巨噬细胞极化。免疫荧光结果显示当CXCR4高表达时,AMD3100能够抑制肿瘤纤维化和Ⅰ型胶原蛋白的沉积以及增加CD8+T细胞的浸润。结论:AMD3100在肿瘤的调控中发挥促癌和抑癌双重作用。当CXCR4低表达时,AMD3100可以氧化失活PTEN激活AKT信号通路,促进肿瘤细胞的增殖。当CXCR4高表达时,AMD3100在体外能够通过阻断CXCL12/CXCR4信号轴起到部分逆转肿瘤生长的作用。在体内能够调控肿瘤免疫微环境,促进M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化,减少瘤内MDSC,降低肿瘤纤维化、促进CD8+T细胞的浸润,从而起到抑癌作用。本研究为以AMD3100为例,为靶向CXCL12/CXCR4信号轴的药物在临床前以及临床研究中的安全用药、精准用药和联合用药提供了理论依据。