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第一部分:血管紧张素Ⅱ促进树突状细胞缝隙连接蛋白43的表达及缝隙连接通讯的形成研究目的:本部分研究探讨血管紧张素（angiotensin,Ang）Ⅱ对树突状细胞（dendritic cell,Dc）中缝隙连接蛋白（connexin,Cx）43的表达、DC与DC细胞间缝隙连接通讯的建立、DC表面共刺激分子CD40、CD80、CD86和抗原递呈分子主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex,MHC）-Ⅱ的表达和DC对T淋巴细胞激活能力的影响,试图进一步阐明AngⅡ促进免疫炎症反应加速动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）的具体机制。研究方法:采用培养的C57BL/6小鼠骨髓来源的DC,以10-6mol/L AngⅡ处理5、15、30、60分钟,及以不同浓度(10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L)处理30分钟,或经AngⅡ10-6 mol/L、LPS100ng/ml、AngⅡ+LPS处理或用10-5mol/L缬沙坦（Valsartan,Val）预处理30分钟后再加入AngⅡ+LPS干预24小时或5×10-5mol/L庚醇（Heptanol,Hep）预处理30分钟后加入AngⅡ干预24小时,以免疫印迹法检测DC细胞中Cx43的表达,划痕标记免疫荧光示踪技术观察DC细胞间缝隙连接通讯的形成,流式细胞术检测DC表面CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表达,混合淋巴细胞反应检测DC对T淋巴细胞的激活能力。结果:AngⅡ呈浓度依赖性的促进Cx43的表达,10-6 mol/L AngⅡ作用最强（相对表达量:0.51±0.03 versus Control 0.23±0.03,P<0.05）,在作用30分钟时达最大效应（相对表达量:0.59±0.08versus 0 min 0.19±0.05,P<0.01）,1小时时仍有刺激作用;LPS能显著促进Cx43的表达（相对表达量:0.78±0.03 versus Control0.40±0.06,P<0.01）,AngⅡ增强LPS的促进作用（相对表达量:1.01±0.08 versusLPS 0.78±0.03,P<0.05）,AT1受体拮抗剂缬沙坦则抑制这种增强作用（相对表达量:0.69±0.09 versus AngⅡ+LPS 1.01±0.08,P<0.01）;AngⅡ能显著增强DC细胞间的缝隙连接通讯,这种作用被缬沙坦抑制,被庚醇完全取消;AngⅡ促进DC刺激T淋巴细胞增殖的作用不明显（SI:1.45±0.15 versus Control1.05±0.10,P>0.05）,但能增强LPS活化的DC对T淋巴细胞的刺激能力（SI:3.91±0.19 versus LPS 3.15±0.21 P<0.01）,这种增强作用被AT1受体拮抗剂缬沙坦抑制（2.84±0.17 versus AngⅡ+LPS 3.91±0.19,P<0.01）,而庚醇则取消了二者的作用（1.81±0.13 versus AngⅡ+LPS 3.91±0.19,P<0.01）。本部分研究结果表明,AngⅡ能促进DC表达Cx43,增强LPS诱导的Cx43在DC的表达并促进DC细胞间缝隙连接通讯的建立,AngⅡ还能增强LPS诱导的DC对T淋巴细胞的激活能力,但是AngⅡ对DC表面CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表达影响不明显,提示AngⅡ对DC的成熟和有效激活可能主要起协同作用,其具体分子机制和在体持续作用条件下对DC的影响有待进一步研究。第二部分:血管紧张素（1-7）增强血管紧张素Ⅱ诱导的DCERK1/2的磷酸化研究目的:本部分研究探讨DC是否具备完整的肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system,RAS）,AngⅡ对DC中与DC表面CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表达有密切关系的丝裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated proteinkinases,MAPK）活化的影响和通过的途径以及Ang-（1-7）对AngⅡ介导的DC中MAPK细胞信号转导通路的作用。研究方法:应用逆转录-聚合酶链式反应法（reverse transcription-polymerasechain reaction,RT-PCR）检测小鼠骨髓来源树突状细胞（bone marrow-deriveddendritic cell,BMDC）中血管紧张素转化酶2（angiotensin-converting enzyme-relatedcarboxypeptidase,ACE2）和Ang-（1-7）受体Mas mRNA的表达;小鼠BMDC经Ang-（1-7）、缬沙坦（valsartan,Val）、PD123319和D-Ala7-Ang-（1-7）预处理后加入AngⅡ,然后收集细胞以免疫印迹法检测细胞中MAPK的激活。研究结果:1、小鼠BMDC有ACE2和Mas受体mRNA的表达,其表达量与小鼠心肌细胞的表达量相当;2、AngⅡ(5 min,10-7 mol/L)迅速刺激细胞外信号相关激酶（extracellular signal-related kinase,ERK1/2）磷酸化（相对表达量:0.46±0.09versus 0 min 0.24±0.04,P<0.05）,这种效应能被AngⅡ1型（AngⅡtype1,AT1）受体拮抗剂缬沙坦部分抑制（相对表达量:0.72±0.05 versus AngⅡ0.91±0.13,P=NS）,而几乎被AngⅡ2型（AngⅡtype 2,AT2）受体拮抗剂PD123319完全取消（相对表达量:0.52±0.08 versusAngⅡ0.91±0.13,P<0.01）;3、Ang-（1-7）可单独诱导ERK1/2的磷酸化（相对表达量:0.57±0.05 versus comrol 0.35±0.04,P<0.01）,Ang-（1-7）与AngⅡ共同作用则显著增强ERK1/2的磷酸化（相对表达量:1.20±0.20 versus AngⅡ0.91±0.13,P<0.05）,这种增强作用能被Ang-（1-7）受体拮抗剂D-Ala7-Ang-（1-7）消除（相对表达量:0.63±0.07 versus AngⅡ+Ang-（1-7）0.95±0.08,P<0.01）;4、Ang-（1-7）和AngⅡ对p38和c-Jun N-terminal kinase（JNK）的磷酸化均无影响。本部分研究结果表明:1、DC配备有完整的RAS系统;2、AngⅡ通过AT2受体刺激小鼠BMDC细胞中ERK1/2的磷酸化;3、Ang-（1-7）能增强这种作用。DC产生的Ang-（1-7）可通过该途径在局部拮抗AngⅡ的致炎作用。第三部分:内源性血管紧张素Ⅱ促进动脉粥样硬化斑块内树突状细胞表面缝隙连接蛋白43的表达及其成熟研究目的:本部分研究拟建立内源性高AngⅡApoE-/-小鼠动物模型,探讨在体持续作用情况下AngⅡ对AS斑块中DC表面Cx43及成熟标志物之一CD40的表达,以及对AS发生发展的影响。研究方法:采用两肾一夹（two kidney one clip,2K1C）方法建立内源性高AngⅡApoE-/-小鼠动物模型,其中一组予AT1受体拮抗剂缬沙坦（valsartan,Val）4mg/kg.d-1灌胃,并设假手术组（sham）,喂养10周后有创法测动脉血压,放射免疫法检测血浆中肾素活性和AngⅡ浓度,油红O染色观察斑块负荷,抗SMCα-actin染色观察斑块纤维帽状态及斑块稳定性,免疫组化双染色法检测斑块中DC细胞Cx43和CD40表达。结果:模型建立成功,2K1C组ApoE-/-小鼠血压显著升高（MBP:122±6 mmHgversus sham 88±3 mmHg,P<0.05）,Val 4mg/kg.d-1灌胃对升高的血压无影响（MBP:123±5 mmHg versus sham 88±3 mmHg,P<0.01;versus 2K1C 122±6mmHg,P=NS）。2K1C组ApoE-/-小鼠动脉AS斑块负荷显著重于sham组,2K1C+Val组斑块负荷明显较2K1C组轻;2K1C组ApoE-/-小鼠动脉AS斑块呈不稳定形态,sham组和2K1C+Val组斑块则呈稳定斑块形态;2K1C组小鼠斑块中DCCx43、CD40表达显著增高,而2K1C+Val组上述分子表达明显减少。本部分研究结果表明:内源性高AngⅡ持续作用可促进ApoE-/-小鼠AS斑块中的DC表达Cx43和成熟（高表达CD40）并加速AS的发展,诱导斑块不稳定,该作用可被AT1受体拮抗剂Val抑制,提示在体情况下,AngⅡ能通过AT1受体诱导DC产生Cx43促进DC成熟,启动和加速斑块内的免疫炎症反应,从而促进AS的发生发展。