大多数临床上应用的生物材料都要与生物组织接触并发生相互作用,因此保障生物材料的安全有效性,提高其生物相容性至关重要。任何生物医学材料在临床应用前都需要进行充分的生物相容性评估,而生物材料生物标志物可以在临床应用前识别生物材料的潜在风险,更早、更灵敏、更快速地实现生物学效应评估。另外,应用生物标志物可以在材料设计初期对大量新材料进行快速筛选,减少研发时间与资金投入。因此,生物材料生物标志物的研究有非常重要的意义。纳米银是一种在医疗器械、食品、化妆品等领域应用广泛的抗菌剂,但有大量研究显示纳米银具有一定的细胞毒性,因此研究能够早期评估纳米银细胞毒性的生物标志物很有必要。目前对纳米银细胞毒性生物标志物的研究存在着一些不足。一方面,研究都基于某一个单一组学进行,缺少多组学的生物标志物联合分析,这样会导致在基因/蛋白质/代谢物各个水平上生物标志物不一致的问题。另一方面,筛选获得的生物标志物缺乏实验验证,由于研究生物标志物时应用生物组学技术检测基因/蛋白质/代谢物表达水平可能会出现技术误差导致的结果偏差,而且应用生物信息学方法也只是在理论上分析基因/蛋白质/代谢物标志物的功能,还只是出于“纸上谈兵”的阶段,因而限制了筛选结果的实际应用。针对上述不足,本论文采用基于多组学（基因组学、蛋白质组学、代谢组学）的方法对纳米银细胞毒性生物标志物进行了高通量筛选,并对筛选出的生物标志物进行了一系列验证实验,最终获得能够评估纳米银细胞毒性的生物标志物。还进一步基于不同组学层面筛选到的基因标志物、蛋白质标志物和代谢物标志物的关联性构建了从基因转录→蛋白质表达→代谢物变化的分子生物学途径,并进行相应的关联性验证实验以及通路功能验证实验,最后阐明了不同层次生物标志物在纳米银细胞毒性中发挥的具体作用机制。本论文的主要工作内容包括:1.纳米银的制备与表征:采用硼氢化钠还原硝酸银的方法制备纳米银,酶标仪测定的纳米银最大吸收波长为389nm,透射电镜表征的纳米粒径为20.45±2.72nm,等离子体发射光谱仪测得纳米银浓度为874mg/L。2.生物标志物的筛选:对课题组前期获得的纳米银作用人皮肤成纤维细胞4、8、24h后的基因组、蛋白质组、代谢组学数据进行表达模式分析、生物学通路分析、多组学联合筛选以及关联性分析,筛选出在同一时间点显著差异表达且表达模式一致、参与共同细胞毒性相关通路且显著差异代谢物位于显著差异表达基因/蛋白质下游的3个基因,3个蛋白质,2个代谢物作为目标生物标志物。3.生物标志物表达水平验证实验:采用RT-PCR、Western blot、LC-MS方法分别在RNA水平、蛋白质水平、代谢物水平上对筛选到的3个目标基因标志物、3个目标蛋白质标志物、2个目标代谢物标志物进行表达水平验证实验,结果发现2个基因、2个蛋白质、2个代谢物获得了验证,在验证实验与组学实验结果中都发生较一致的下调表达。4.生物标志物功能水平验证实验:对参与多条细胞毒性相关通路的目标基因标志物CPT1C、PCK2进行功能验证实验。首先,通过CRISP/Cas9技术成功构建CPT1C、PCK2基因敲除/过表达稳定细胞株;通过ATP含量检测实验和细胞增殖率评价实验,确定CPT1C基因具有调控细胞能量代谢和增殖生长的生物学功能,通过柠檬酸含量检测实验和细胞乳酸代谢水平检测实验,确定PCK2基因具有调控细胞柠檬酸合成水平和糖酵解水平的生物学功能,以上功能与纳米银细胞毒性涉及的生物过程相关,最终确定CPT1C、PCK2基因可以作为评估纳米银细胞毒性的最终基因标志物;5.纳米银生物标志物的关联性和作用机制分析:基于前期筛选到的基因/蛋白质/代谢物标志物的上下游关系,构建了2条分子生物学路径,分别是基于脂肪酸代谢通路的分子路径:上游基因CPT1C转录→下游代谢物L-棕榈酰肉碱变化,以及基于三羧酸循环通路的分子路径:上游基因PCK2转录→上游蛋白质MDH2/ACO2表达→下游代谢物苹果酸变化。对筛选获得的CPT1C、PCK2基因,构建敲除/过表达稳定细胞株,之后应用Western blot和LC-MS方法验证基因标志物、蛋白质标志物、代谢物标志物之间关联性,应用不同的代谢通路相关试剂盒进行了通路功能验证。结果显示,代谢物L-棕榈酸肉碱的表达水平会随着CPT1C基因表达水平变化发生同步变化,蛋白质ACO2、代谢物苹果酸的表达水平会随着PCK2基因表达水平变化发生同步变化,最终确定蛋白质ACO2和代谢物L-棕榈酸肉碱、苹果酸可以作为评估纳米银细胞毒性的最终蛋白质和代谢物标志物。另外,结果表明纳米银能够自上而下影响CPT1C基因标志物的表达→L-棕榈酰肉碱代谢物标志物的变化→影响细胞内乙酰辅酶A的生成,进而导致细胞毒性表现为影响细胞能量代谢,导致细胞毒性。同时,纳米银能够自上而下的影响PCK2基因标志物的表达→ACO2蛋白质标志物的表达→柠檬酸堆积→苹果酸代谢物标志物的变化→导致细胞毒性表现为影响细胞内线粒体膜电位水平、ATP生成以及ROS含量,进而造成能量代谢受阻,细胞氧化损伤。