大豆(Glycine max (L.) Merr.)在我国已有2000多年的栽培与食用历史。大豆富含蛋白质、碳水化合物、维生素和矿物质。大豆种子发芽过程中发生一系列生理生化变化,酶源被激活,酶得以形成,蛋白、碳水化合物等贮藏物质被分解成芽体可利用小分子物质。控制大豆发芽条件,可富集γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)等大豆中原来含量低或不具有的功能成分。植物中GABA主要由GABA支路和多胺降解途径合成,其中谷氨酸脱羧酶(GAD, EC4.1.1.15)和二胺氧化酶(DAO, EC1.4.3.6)分别是这两条途径中合成GABA的限速酶。植物在盐和低氧等胁迫条件下能够强烈激发GAD和DAO活力,导致植物中GABA的显著积累。本文研究了大豆发芽期间贮藏物质的动员和GABA的动态变化；采用盐和低氧胁迫研究大豆发芽过程中GABA的富集与调控机理,并对盐胁迫、低氧胁迫及其联合对发芽大豆富集GABA及发芽大豆不同部位中GAD、DAO及CaM基因表达水平的差异,ABA对发芽大豆GABA富集及调控机理进行了研究。主要研究结果如下：1、大豆种子在30℃浸泡4h,可使大豆种子充分吸水,发芽率高,并有利于GABA的富集。随着培养温度的升高和时间的延长,发芽大豆生长加快,呼吸作用增强,可溶性糖含量下降,还原糖、可溶性蛋白、游离氨基酸和GABA含量升高,干物质含量随发芽时间的延长呈下降趋势。相关性分析表明,GABA富集量与芽长、呼吸强度、可溶性蛋白和游离氨基酸具有极显著的正相关(r,0.878～0.943)。综合考虑发芽大豆品质和GABA累积量等因素,大豆在30℃黑暗条件下发芽5d,是生产富含3ABA发芽大豆的适宜条件。大豆发芽过程中子叶和胚中GAD和DAO活力均呈现先升高后降低的趋势。发芽3d后,子叶和胚中的GAD活力达到最大值。子叶和胚中DAO的活力分别在发芽5d和4d达到最大值。2、应用响应面试验研究了NaCl浓度、培养时间和温度对大豆发芽富集GABA的影响,拟合出发芽大豆GABA富集与盐胁迫培养条件之间的回归模型。最优条件是：NaCl浓度133.5mM、培养时间5.5d、培养温度为33.3℃,在此条件实测GABA富集量为1.197mg/g DW。方差分析和验证试验显示,模型可准确的预测盐胁迫下大豆发芽过程中GABA的富集量。最佳通氧处理时机(正常发芽和胁迫处理时间组合)研究表明：优化的胁迫方式是在30℃用去离子水于黑暗条件下培养2d后通气胁迫处理2d。在优化的低氧胁迫时机下进行大豆发芽,其生理生化指标发生显著变化,GABA含量为胁迫前的4.5倍、原料的13.5倍。相关性分析表明GABA含量和其它生理生化指标间相关性极显著。通过响应面分析得到低氧胁迫下发芽大豆富集GABA的最优条件：培养温度30.5℃、培养液pH4.13、通气量0.91L/min,此条件下GABA富集量为2.65mg/gDW,是原料的16.6倍。3、2.5mM的AG处理对发芽大豆芽长和GAD活力无影响,但DAO活力受到极显著抑制；低氧胁迫导致大豆胚中GABA富集量有32%来自DAO活力升高而促进的多胺降解途径。低氧胁迫下,不同浓度的谷氨酸、磷酸吡哆醛、精氨酸、CuCl2,NaCl和CaCl2对发芽大豆中GABA的积累及GAD和DAO活力有显著影响,各自的GABA富集量分别为4.07,3.02,3.50,3.26,4.00和3.30mg/g DW,均显著高于正常发芽(CK)和低氧胁迫处理(CK0)。大豆子叶和胚中GAD和DAO有不同的活性分布,胚中的酶活力高于子叶。在低氧胁迫下,Glu和NaCl对发芽大豆中GABA富集影响最大,可达到4.07和4.00mg/g DW。4、低氧联合盐胁迫下,大豆子叶和胚中GAD活力是单纯低氧胁迫的1.64和1.76倍。在此基础上添加CaCl2,则GAD活力是单纯低氧胁迫的1.80和2.26倍, Glu含量分别比单纯低氧胁迫下降低了44.50%和44.37%,说明Ca2+对GAD活力具有明显的激活作用。低氧联合盐胁迫加入EGTA后,发芽大豆中Ca2+被螯合,阻断了Ca2+与CaM的结合,使GAD活力降低,导致发芽大豆胚中Glu积累。与低氧联合盐胁迫相比,子叶和胚中G]u含量分别提高了18.32%和35.49%。5、在低氧联合盐胁迫下,发芽大豆子叶和胚中DAO活力比单纯的低氧胁迫提高了36.52%和28.43%,而fPut含量分别比低氧胁迫下降7.15%和37.98%说明低氧联合盐胁迫促进了腐胺向GABA的转化。低氧联合盐胁迫加CaCl2处理后,发芽大豆子叶和胚中的fPut含量和GAD活力升高。Ca2+提高了GAD活力,使通过GABA支路转化的GABA量提高,作为一种调节,多胺降解途径间接受到抑制,从而使发芽大豆子叶和胚中的fPut得到积累。6、低氧联合盐胁迫下,GABA的两条富集途径均被加强,发芽大豆子叶和胚中GABA含量是单纯低氧胁迫的1.47和2.00倍,低氧和盐胁迫对GABA的富集具有累加效应。低氧联合盐胁迫下添加AG,发芽大豆子叶和胚中GAD基因表达量分别增加了53.76%和173%,同时CaM表达也发生了相应的变化,说明DAO活力受到抑制时,多胺降解途径受阻,诱导了GAD基因强烈表达,进而补充DAO活力抑制后造成的GABA下降量。低氧联合盐胁迫下胚中5条CaM基因表达均比单纯低氧胁迫高,表明低氧联合盐胁迫促进了CaM基因的表达,进而促进了GAD活力,二者共同引起发芽大豆GABA的富集。低氧联合盐胁迫添加Ca2+后,子叶和胚中GAD基因表达量分别比未添加组增加0.54和2.98倍,低氧联合盐胁迫处理下,Ca2+通过与CaM结合,形成钙调素,促进发芽大豆GAD基因表达,增加了发芽大豆GABA的富集量。7、低氧联合盐胁迫下,从子叶(Coty)到芽尖(RadⅡ)GAD活力逐渐升高,其中芽尖部分活力是子叶的3.69倍。外源ABA处理使发芽大豆内源ABA和Ca2+含量升高,SCaM1和SCaM2表达增加,显著提高了GAD活力,而Glu含量显著降低。Flu则使内源ABA和Ca2+含量和GAD活力显著降低,并引起Glu的积累。表明发芽大豆内Ca2+浓度受ABA刺激后迅速提高,并使相应的CaM表达增强,从而激活了GAD活力,更多的Glu转化为GABA,引起发芽大豆内Glu的消耗。与对照相比,ABA处理下发芽大豆GAD活力提高,而基因表达水平无显著差异,而Flu处理降低了GAD活力,却提高了GAD基因的表达。表明在低氧联合盐胁迫下,GAD mRNA的表达并不是富集GABA的唯一因素,GAD蛋白的激活可能起主要作用。8、Rad Ⅰ部分的DAO活力是发芽大豆活力最高的部分,Rad Ⅱ的DAO活力下降,但仍显著高于子叶。在低氧联合盐胁迫下加入ABA后,发芽大豆从子叶到芽尖5部位的fPut和fSpd均比对照增加。发芽大豆胚中DAO基因的表达极显著高于子叶。ABA处理显著提高DAO活力,促进发芽大豆fPut和fSpd的积累。加入Flu后二者含量下降,表明ABA可促进发芽大豆fPut和fSpd的积累。DAO活力增强,多胺积累,二者的联合作用加快了Put向GABA转化,GABA得以富集。低氧联合盐胁迫下加入ABA后,RadⅡ部位DAO表达量下降,其它部位变化无显著差异。Flu处理降低了DAO活力,却促进了DAO基因的表达。胚部GAD活力、DAO活力和GABA含量(以可溶性蛋白计算)均高于子叶,表明胚部是发芽大豆GABA的主要生成部位。