【摘 要】
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目的:糖尿病肾病（Diabetic nephropathy,DN）发病机制复杂,足细胞损伤是其重要的发病机制之一。近年来研究发现DN中普遍存在线粒体功能障碍,因此探讨足细胞线粒体功能及寻找改善线粒体功能的药物对防治DN具有重要意义。黄芪皂苷甲（Astragaloside Ⅳ,AS-Ⅳ）具有多种药理活性,已证实对DN小鼠及足细胞有确切的保护作用,但其作用机制尚不明确。本研究通过建立DN体内、外模型,
【基金项目】
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上海中医药大学“高峰高原创新团队”高峰造尖行动计划（15-DX-03GD）; 上海市医学重点专科（ZK2015A18）
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目的:糖尿病肾病（Diabetic nephropathy,DN）发病机制复杂,足细胞损伤是其重要的发病机制之一。近年来研究发现DN中普遍存在线粒体功能障碍,因此探讨足细胞线粒体功能及寻找改善线粒体功能的药物对防治DN具有重要意义。黄芪皂苷甲（Astragaloside Ⅳ,AS-Ⅳ）具有多种药理活性,已证实对DN小鼠及足细胞有确切的保护作用,但其作用机制尚不明确。本研究通过建立DN体内、外模型,探讨AS-Ⅳ对DN足细胞损伤及线粒体功能的保护作用和相关机制,从而为临床应用AS-Ⅳ提供新的理论依据。方法:1.体外研究:体外培养永生化小鼠足细胞,CCK8法筛选AS-Ⅳ的安全浓度。分化足细胞饥饿后给予正常糖（5.5 m M Glucose,NG）、甘露醇（30 m M Mannitol,MA）、高糖（30 m M Glucose,HG）、高糖+AS-Ⅳ（3、10、20、40、80μM）干预。CCK8法检测AS-Ⅳ对高糖诱导足细胞存活率的影响;流式细胞术检测足细胞凋亡;Western blot检测不同浓度AS-Ⅳ对高糖诱导足细胞中Nrf2-ARE/TFAM信号通路相关蛋白的表达;双荧光素酶报告基因检测及染色质免疫共沉淀（ChIP）检测AS-Ⅳ对Nrf2转录活性的影响。分别采用Nrf2抑制剂Trig（100μM）与TFAM siRNA,观察Nrf2/TFAM在AS-Ⅳ调控足细胞线粒体功能中的作用。Western blot检测线粒体生物合成相关因子NRF-1、PGC-1α、TFAM,线粒体呼吸链复合蛋白,SOD2蛋白及线粒体凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved caspase 3、Cytc的表达;荧光素酶法检测ATP含量;q RT-PCR检测线粒体DNA（mtDNA）拷贝数;荧光探针Mito Tracker Red、Mito Sox Red、DHE检测足细胞内活细胞线粒体、线粒体ROS、细胞内ROS;酶促反应检测线粒体中GSH-PX活性;JC-1染色激光共聚焦检测线粒体膜电位;应用Caspase 3底物检测Caspase 3活性。2.体内研究:选取6周龄雄性C57BL/6J小鼠40只给予连续2天腹腔注射链脲酶素（STZ）100 mg/kg·d造模。8周后随机分为4组:正常组（NC）、模型组（DN）、DN+AS-Ⅳ组、DN+AS-Ⅳ+Trig组。药物干预10周后处死动物,检测小鼠一般情况、尿蛋白及肾功能变化;采用免疫组化、PAS染色、TUNEL染色观察肾脏病理变化;Western blot检测足细胞标记蛋白、Nrf2-ARE/TFAM通路相关蛋白的表达;以及肾脏线粒体功能相关指标的检测。结果:1.体外研究:CCK8结果显示AS-Ⅳ浓度在0.3-80μM之间干预24 h对足细胞增殖无明显影响。浓度在20、40、80μM时可明显改善高糖诱导的足细胞存活率、减少细胞凋亡及上调Nrf2-ARE/TFAM信号通路。AS-Ⅳ可促进Nrf2的转录活性,调控足细胞线粒体功能,表现为促进线粒体生物合成刺激因子NRF-1、PGC-1α、TFAM、线粒体呼吸链蛋白表达,增加mtDNA拷贝数、ATP含量及活细胞线粒体;抑制线粒体ROS、细胞内ROS生成、Caspase 3活性及凋亡蛋白Bax、Cleaved caspase3、Cytc表达;增加GSH-PX活性、SOD2、Bcl-2蛋白表达,上调线粒体膜电位。分别抑制Nrf2与TFAM后,结果显示AS-Ⅳ对高糖诱导足细胞的保护作用及线粒体功能的改善作用明显减弱,表现为Nrf2-ARE/TFAM信号通路被抑制。2.体内研究:AS-Ⅳ可明显改善STZ小鼠一般情况、尿蛋白、肾功能、肾脏病理及足细胞损伤;上调Nrf2-ARE/TFAM信号通路;改善肾脏线粒体功能指标,包括促进NRF-1、PGC-1α、TFAM、线粒体呼吸链蛋白、SOD2、Bcl-2蛋白表达、GSHPX活性,增加mtDNA拷贝数、ATP含量;抑制Bax、Cleaved caspase 3、Cytc蛋白表达。Nrf2抑制剂可减弱AS-Ⅳ的有益作用。结论:1.体外研究证实,AS-Ⅳ可通过上调Nrf2-ARE/TFAM信号通路调控线粒体功能,促进线粒体生物合成、抑制线粒体氧化应激、减少线粒体凋亡从而保护高糖诱导的足细胞损伤。并且在足细胞中证实了Nrf2可直接与TFAM相作用调控线粒体功能。2.体内研究证实,AS-Ⅳ可以改善STZ小鼠肾脏病理及肾功能,减少蛋白尿,保护足细胞损伤。其作用机制与上调肾组织中Nrf2-ARE/TFAM信号通路从而调控线粒体功能有关。
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