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穴位敏化是指穴位由生理的“静息”态转化为疾病或伤害刺激时的“激活”态。具体表现为穴位对外界的刺激(力、热、光、电等)更加敏感，穴位的感受野较原来扩大和传感增强的现象。针灸历经几千年的发展和传承，穴位敏化现象一直是指导临床医师寻找有效穴位并保证针灸治疗效应的重要基础和依据。尽管穴位敏化现象已广为人知，并且在临床实践中得到广泛应用，但人们对该现象背后的机制知之甚少，且在这方面的研究也寥寥可数。
本研究以膝骨关节炎(Knee Osteoarthritis, KOA)模型为研究载体，通过观察脊髓水平甘氨酸系统的变化，重点探讨穴位敏化的中枢机制。甘氨酸作为脊髓内一种重要的抑制性神经递质，在控制外周感觉信息上传大脑时扮演重要角色。外周损伤引起脊髓背角甘氨酸能神经元的前馈抑制功能降低，导致触觉等非伤害性感觉信息经伤害性传导通路传输，即外周生理刺激异常放大为病理性刺激，最终产生中枢敏化现象。而中枢敏化能够扩大外周感受野的感受范围并增强感受野的传感性，即在阈下刺激即可激活外周感受野，最终引起外周信息易化放大上行传入高位中枢。那么，穴位敏化是否是由中枢敏化引起的呢？甘氨酸能神经元是否在穴位敏化的发生发展过程中发挥重要作用？为此，本研究以脊髓背角甘氨酸能神经元作为切入点，围绕甘氨酸系统的调控展开多层次研究，探讨穴位敏化发生发展的中枢机制。
研究一：KOA引起特定穴位敏化现象
【目的】明确KOA引起哪些穴位发生敏化，并观察电针(Electroacupuncture, EA)刺激敏化穴位的治疗效应。
【方法】
1.成年雄性SD大鼠(200-250 g)28只，随机分为Sham组和KOA组，分别在大鼠左侧膝关节腔内注射无菌生理盐水和单碘醋酸盐(Monosodium Iodoacetate, MIA)；然后取造模后第3、7和14天检测穴位区机械痛阈(每组8只动物)，穴位皮肤肥大细胞总数及脱颗粒比例(每组6只动物)；
2.成年雄性SD大鼠(200-250 g)30只，随机分为3组：Sham组,KOA+EA组和KOA+ShamEA组，使用EA刺激敏化穴位，观察EA能否产生治疗效应。
【结果】
1.与Sham组相比，KOA大鼠双侧ST35(犊鼻穴)穴位痛阈显著降低(P＜0.05)，肥大细胞总数和脱颗粒比例显著增加(P＜0.05)；而GB37(光明穴)和非穴位区(Non-Acu)则无明显变化(P＞0.05)；
2.电针刺激双侧ST35能有效提高KOA大鼠患侧缩足阈值和患侧承重比例(P＜0.05)，并减轻关节软骨损伤，提高关节病理评分(P＜0.05)。
【结论】单侧KOA模型可引起双侧ST35穴位敏化，但对GB37穴位和Non-Acu区无影响；且EA刺激敏化穴位(ST35)有效改善KOA疼痛相关行为学及关节病理损伤。
研究二：脊髓背角甘氨酸能神经元在穴位敏化中的作用
【目的】观察KOA大鼠脊髓甘氨酸系统的变化，并明确其对外周穴位敏化的作用。
【方法】
1.首先观察KOA大鼠脊髓内甘氨酸系统是否发生变化，将40只雄性SD大鼠随机分为Sham组和KOA组，取脊髓腰膨大进行免疫荧光染色(每组8只动物)或Westernblot(每组6只动物)检测c-Fos,甘氨酸转运体1/2(Glycine Transportor 1/2， GlyT1/2)表达情况；另外每组取6只动物进行脊髓微透析，检测组织间透析液甘氨酸的含量；
2.为研究鞘内甘氨酸含量对穴位敏化的影响，将28只雄性SD大鼠随机分为KOA+生理盐水(Normal Saline, NS)组和KOA+Glycine组，造模后持续鞘内泵注生理盐水或甘氨酸(0.2 mol/L)，其中每组8只进行穴位痛阈的检测，其余动物进行免疫组织化学染色观察肥大细胞总数及脱颗粒情况；
3.为研究GlyT2特异性抑制剂ORG25543对外周穴位敏化产生的影响，将28只雄性SD大鼠随机分为KOA+NS组和KOA+ORG25543组，于造模后间断静脉注射生理盐水或ORG25543，其中每组8只大鼠进行穴位痛阈的检测，其余动物进行免疫组织化学染色观察肥大细胞总数及脱颗粒情况；
4.为观察特异性下调患侧脊髓背角GlyT2蛋白含量对外周穴位敏化的影响，将28只雄性SD大鼠随机分为KOA+Con-shRNA组和KOA+GlyT2-shRNA组，其中每组8只大鼠进行穴位痛阈的检测，其余动物进行免疫组织化学染色观察肥大细胞总数及脱颗粒情况；
5.为观察特异下调脊髓背角GlyT2对EA刺激敏化穴位是否产生影响，将32只雄性SD大鼠随机分为KOA组、KOA+EA组、KOA+EA+Con-shRNA组和KOA+EA+GlyT2-shRNA组，检测动物患侧缩足阈值、患侧承重比例和关节软骨病理评分。
【结果】
1.免疫荧光结果显示KOA大鼠双侧脊髓背角Ⅰ-Ⅲ层c-Fos表达量显著高于对照组(P＜0.05)；Westernblot显示同样的结果(P＜0.05)；我们发现双侧脊髓背角组织间隙甘氨酸含量显著降低(P＜0.05)。通过Westernblot我们还发现KOA大鼠双侧脊髓背角GlyT1蛋白含量未发生明显变化(P＞0.05)，但是GlyT2显著增加(P＜0.05)，免疫荧光染色得到同样的结果(P＜0.05)；
2.鞘内泵注甘氨酸提高KOA大鼠双侧ST35穴位痛阈(P＜0.05)并减少ST35穴位区肥大细胞总数及脱颗粒比例(P＜0.05)，但对GB37穴位和Non-Acu区无明显影响；
3.静脉注射GlyT2特异性抑制剂ORG25543提高KOA大鼠双侧ST35穴位痛阈(P＜0.05)并减少ST35穴位区肥大细胞总数及脱颗粒比例(P＜0.05)，但对GB37穴位和Non-Acu区无明显影响；
4.特异下调脊髓背角GlyT2提高KOA大鼠双侧ST35穴位痛阈(P＜0.05)并减少ST35穴位区肥大细胞总数及脱颗粒比例(P＜0.05)，但对GB37和Non-Acu无明显影响；
5.GlyT2-shRNA逆转了EA的镇痛作用，主要表现为动物的缩足阈值(P＜0.05)和患侧承重比例(P＜0.05)都显著降低；而脊髓GlyT2-shRNA注射并不影响EA对关节损伤和关节病理评分的改善(P＞0.05)。
【结论】KOA引起双侧脊髓背角GlyT2表达升高，使甘氨酸回摄取量增加，继而引起脊髓背角组织间隙甘氨酸含量降低，使外周传入信号去抑制，最终导致双侧ST35穴位发生敏化。
研究三：延髓头端腹内侧区(Rostral Ventromedial Medulla, RVM)-脊髓下行抑制通路参与穴位敏化的调控
【目的】为研究脊髓上中枢在外周穴位敏化中的作用，观察RVM下行调控系统对外周穴位敏化的影响。
【方法】
1.首先观察KOA小鼠RVM区神经元活化情况，将32只雄性C57BL/6小鼠随机分为Sham组和KOA组，在造模后第1、3、7和14天进行免疫荧光染色，每组4只动物，检测RVM区c-Fos在不同时间点表达情况；
2.为研究KOA模型引起哪种类型神经元活化，将3个不同品系的小鼠VgatCre、Vglut2Cre和Pet1Cre随机分为Sham组和KOA组，其中每组4只；在造模后第3天进行免疫荧光染色，观察RVM区不同类型神经元c-Fos的表达情况；
3.为观察RVM区GABA能神经元是否影响脊髓背角甘氨酸能神经元兴奋性，取4只VgatCre小鼠，在RVM区注射rAAv-Ef1α-DIO-hChR2-mCherry病毒，3周后电生理记录脊髓背角甘氨酸能神经元兴奋性变化；
4.观察RVM区GABA能神经元活性是否对外周穴位敏化产生影响，在VgatCre小鼠RVM区注射rAAv-Ef1α-DIO-hChR2-mCherry或rAAV-Ef1α-DIO-eNpHR3.0-mCherry，病毒表达3周后构建KOA模型；通过蓝光或黄光刺激等方式调控GABA能神经元活性，然后取相应穴位皮肤观察肥大细胞总数和脱颗粒比例。
【结果】
1.通过免疫荧光染色，发现在MIA注射后第1、3、7、和14天，RVM区c-Fos表达明显增加，在第3天增加最明显(P＜0.05);
2.KOA小鼠RVM区GABA能神经元、谷氨酸(Glu)能神经元和5-HT能神经元都发生活化，但大部分(57.7%)活化的神经元类型为GABA能神经元；
3.RVM区GABA能神经元降低双侧脊髓背角甘氨酸能神经元兴奋性；
4.激活RVM区GABA能神经元活性，增加双侧ST35穴位区肥大细胞总数及脱颗粒比例(P＜0.05)，但对GB37穴位和Non-Acu区无明显影响(P＞0.05)；抑制RVM区GABA能神经元活性，降低双侧ST35穴位区肥大细胞总数(P＜0.05)及脱颗粒比例(P＜0.05)，但对GB37穴位和Non-Acu区无明显影响(P＞0.05)。
【结论】RVM区GABA能神经元可能通过抑制双侧脊髓背角甘氨酸能神经元，参与KOA小鼠双侧ST35穴位敏化的形成，且与双侧GB37穴位和Non-Acu区的感受状态无关。
【总结】KOA引起双侧脊髓背角GlyT2表达升高，使甘氨酸回摄取量增加，继而引起脊髓背角组织间隙甘氨酸含量降低，使外周传入信号去抑制，最终导致双侧ST35穴位发生敏化；而RVM区GABA能神经元通过下行抑制双侧脊髓背角甘氨酸能神经元，最终导致双侧ST35穴位敏化。
本研究以膝骨关节炎(Knee Osteoarthritis, KOA)模型为研究载体，通过观察脊髓水平甘氨酸系统的变化，重点探讨穴位敏化的中枢机制。甘氨酸作为脊髓内一种重要的抑制性神经递质，在控制外周感觉信息上传大脑时扮演重要角色。外周损伤引起脊髓背角甘氨酸能神经元的前馈抑制功能降低，导致触觉等非伤害性感觉信息经伤害性传导通路传输，即外周生理刺激异常放大为病理性刺激，最终产生中枢敏化现象。而中枢敏化能够扩大外周感受野的感受范围并增强感受野的传感性，即在阈下刺激即可激活外周感受野，最终引起外周信息易化放大上行传入高位中枢。那么，穴位敏化是否是由中枢敏化引起的呢？甘氨酸能神经元是否在穴位敏化的发生发展过程中发挥重要作用？为此，本研究以脊髓背角甘氨酸能神经元作为切入点，围绕甘氨酸系统的调控展开多层次研究，探讨穴位敏化发生发展的中枢机制。
研究一：KOA引起特定穴位敏化现象
【目的】明确KOA引起哪些穴位发生敏化，并观察电针(Electroacupuncture, EA)刺激敏化穴位的治疗效应。
【方法】
1.成年雄性SD大鼠(200-250 g)28只，随机分为Sham组和KOA组，分别在大鼠左侧膝关节腔内注射无菌生理盐水和单碘醋酸盐(Monosodium Iodoacetate, MIA)；然后取造模后第3、7和14天检测穴位区机械痛阈(每组8只动物)，穴位皮肤肥大细胞总数及脱颗粒比例(每组6只动物)；
2.成年雄性SD大鼠(200-250 g)30只，随机分为3组：Sham组,KOA+EA组和KOA+ShamEA组，使用EA刺激敏化穴位，观察EA能否产生治疗效应。
【结果】
1.与Sham组相比，KOA大鼠双侧ST35(犊鼻穴)穴位痛阈显著降低(P＜0.05)，肥大细胞总数和脱颗粒比例显著增加(P＜0.05)；而GB37(光明穴)和非穴位区(Non-Acu)则无明显变化(P＞0.05)；
2.电针刺激双侧ST35能有效提高KOA大鼠患侧缩足阈值和患侧承重比例(P＜0.05)，并减轻关节软骨损伤，提高关节病理评分(P＜0.05)。
【结论】单侧KOA模型可引起双侧ST35穴位敏化，但对GB37穴位和Non-Acu区无影响；且EA刺激敏化穴位(ST35)有效改善KOA疼痛相关行为学及关节病理损伤。
研究二：脊髓背角甘氨酸能神经元在穴位敏化中的作用
【目的】观察KOA大鼠脊髓甘氨酸系统的变化，并明确其对外周穴位敏化的作用。
【方法】
1.首先观察KOA大鼠脊髓内甘氨酸系统是否发生变化，将40只雄性SD大鼠随机分为Sham组和KOA组，取脊髓腰膨大进行免疫荧光染色(每组8只动物)或Westernblot(每组6只动物)检测c-Fos,甘氨酸转运体1/2(Glycine Transportor 1/2， GlyT1/2)表达情况；另外每组取6只动物进行脊髓微透析，检测组织间透析液甘氨酸的含量；
2.为研究鞘内甘氨酸含量对穴位敏化的影响，将28只雄性SD大鼠随机分为KOA+生理盐水(Normal Saline, NS)组和KOA+Glycine组，造模后持续鞘内泵注生理盐水或甘氨酸(0.2 mol/L)，其中每组8只进行穴位痛阈的检测，其余动物进行免疫组织化学染色观察肥大细胞总数及脱颗粒情况；
3.为研究GlyT2特异性抑制剂ORG25543对外周穴位敏化产生的影响，将28只雄性SD大鼠随机分为KOA+NS组和KOA+ORG25543组，于造模后间断静脉注射生理盐水或ORG25543，其中每组8只大鼠进行穴位痛阈的检测，其余动物进行免疫组织化学染色观察肥大细胞总数及脱颗粒情况；
4.为观察特异性下调患侧脊髓背角GlyT2蛋白含量对外周穴位敏化的影响，将28只雄性SD大鼠随机分为KOA+Con-shRNA组和KOA+GlyT2-shRNA组，其中每组8只大鼠进行穴位痛阈的检测，其余动物进行免疫组织化学染色观察肥大细胞总数及脱颗粒情况；
5.为观察特异下调脊髓背角GlyT2对EA刺激敏化穴位是否产生影响，将32只雄性SD大鼠随机分为KOA组、KOA+EA组、KOA+EA+Con-shRNA组和KOA+EA+GlyT2-shRNA组，检测动物患侧缩足阈值、患侧承重比例和关节软骨病理评分。
【结果】
1.免疫荧光结果显示KOA大鼠双侧脊髓背角Ⅰ-Ⅲ层c-Fos表达量显著高于对照组(P＜0.05)；Westernblot显示同样的结果(P＜0.05)；我们发现双侧脊髓背角组织间隙甘氨酸含量显著降低(P＜0.05)。通过Westernblot我们还发现KOA大鼠双侧脊髓背角GlyT1蛋白含量未发生明显变化(P＞0.05)，但是GlyT2显著增加(P＜0.05)，免疫荧光染色得到同样的结果(P＜0.05)；
2.鞘内泵注甘氨酸提高KOA大鼠双侧ST35穴位痛阈(P＜0.05)并减少ST35穴位区肥大细胞总数及脱颗粒比例(P＜0.05)，但对GB37穴位和Non-Acu区无明显影响；
3.静脉注射GlyT2特异性抑制剂ORG25543提高KOA大鼠双侧ST35穴位痛阈(P＜0.05)并减少ST35穴位区肥大细胞总数及脱颗粒比例(P＜0.05)，但对GB37穴位和Non-Acu区无明显影响；
4.特异下调脊髓背角GlyT2提高KOA大鼠双侧ST35穴位痛阈(P＜0.05)并减少ST35穴位区肥大细胞总数及脱颗粒比例(P＜0.05)，但对GB37和Non-Acu无明显影响；
5.GlyT2-shRNA逆转了EA的镇痛作用，主要表现为动物的缩足阈值(P＜0.05)和患侧承重比例(P＜0.05)都显著降低；而脊髓GlyT2-shRNA注射并不影响EA对关节损伤和关节病理评分的改善(P＞0.05)。
【结论】KOA引起双侧脊髓背角GlyT2表达升高，使甘氨酸回摄取量增加，继而引起脊髓背角组织间隙甘氨酸含量降低，使外周传入信号去抑制，最终导致双侧ST35穴位发生敏化。
研究三：延髓头端腹内侧区(Rostral Ventromedial Medulla, RVM)-脊髓下行抑制通路参与穴位敏化的调控
【目的】为研究脊髓上中枢在外周穴位敏化中的作用，观察RVM下行调控系统对外周穴位敏化的影响。
【方法】
1.首先观察KOA小鼠RVM区神经元活化情况，将32只雄性C57BL/6小鼠随机分为Sham组和KOA组，在造模后第1、3、7和14天进行免疫荧光染色，每组4只动物，检测RVM区c-Fos在不同时间点表达情况；
2.为研究KOA模型引起哪种类型神经元活化，将3个不同品系的小鼠VgatCre、Vglut2Cre和Pet1Cre随机分为Sham组和KOA组，其中每组4只；在造模后第3天进行免疫荧光染色，观察RVM区不同类型神经元c-Fos的表达情况；
3.为观察RVM区GABA能神经元是否影响脊髓背角甘氨酸能神经元兴奋性，取4只VgatCre小鼠，在RVM区注射rAAv-Ef1α-DIO-hChR2-mCherry病毒，3周后电生理记录脊髓背角甘氨酸能神经元兴奋性变化；
4.观察RVM区GABA能神经元活性是否对外周穴位敏化产生影响，在VgatCre小鼠RVM区注射rAAv-Ef1α-DIO-hChR2-mCherry或rAAV-Ef1α-DIO-eNpHR3.0-mCherry，病毒表达3周后构建KOA模型；通过蓝光或黄光刺激等方式调控GABA能神经元活性，然后取相应穴位皮肤观察肥大细胞总数和脱颗粒比例。
【结果】
1.通过免疫荧光染色，发现在MIA注射后第1、3、7、和14天，RVM区c-Fos表达明显增加，在第3天增加最明显(P＜0.05);
2.KOA小鼠RVM区GABA能神经元、谷氨酸(Glu)能神经元和5-HT能神经元都发生活化，但大部分(57.7%)活化的神经元类型为GABA能神经元；
3.RVM区GABA能神经元降低双侧脊髓背角甘氨酸能神经元兴奋性；
4.激活RVM区GABA能神经元活性，增加双侧ST35穴位区肥大细胞总数及脱颗粒比例(P＜0.05)，但对GB37穴位和Non-Acu区无明显影响(P＞0.05)；抑制RVM区GABA能神经元活性，降低双侧ST35穴位区肥大细胞总数(P＜0.05)及脱颗粒比例(P＜0.05)，但对GB37穴位和Non-Acu区无明显影响(P＞0.05)。
【结论】RVM区GABA能神经元可能通过抑制双侧脊髓背角甘氨酸能神经元，参与KOA小鼠双侧ST35穴位敏化的形成，且与双侧GB37穴位和Non-Acu区的感受状态无关。
【总结】KOA引起双侧脊髓背角GlyT2表达升高，使甘氨酸回摄取量增加，继而引起脊髓背角组织间隙甘氨酸含量降低，使外周传入信号去抑制，最终导致双侧ST35穴位发生敏化；而RVM区GABA能神经元通过下行抑制双侧脊髓背角甘氨酸能神经元，最终导致双侧ST35穴位敏化。