论文部分内容阅读
70 kDa热休克蛋白（Heat shock proteins70，HSP70s）是热休克蛋白超家族中的重要成员，作为分子伴侣，它能够促进新生肽的正确折叠，对变性蛋白质恢复正确折叠或不能复性蛋白的降解具有重要作用。研究表明基因在正调控因子作用下首先出现高表达，后期受负调控因子抑制作用恢复至初始水平。HSP70s基因的表达模式也是如此，但是其负调控转录因子还未知。本研究以近江牡蛎HSP70（Crassostrea hongkongensis HSP70，ChHSP70）基因的转录因子为目标，通过 DNA亲和纯化和质谱测序筛选出 ChHSP70的转录调控因子，鉴定出ChHSP70的负转录调控因子之一ChDSP1蛋白；通过RACE技术和三维建模确定ChDSP1的全长cDNA序列以及蛋白质的三维结构；采用EMSA，qRT-PCR，体外过表达以及RNAi等方法鉴定ChDSP1对ChHSP70基因的负调控功能。具体研究结果和结论如下： 近江牡蛎ChDSP1基因cDNA全长1348 bp，编码区609 bp，5’端和3’端非编码区长度分别为119 bp和620 bp。三维建模确定ChDSP1蛋白质含有两个HMG结构域和一个酸性尾巴，每个HMG结构域由三个α螺旋形成一个L型结构，位于C端的酸性尾巴由多个连续的天冬氨酸构成。 原核表达并纯化获得ChDSP1蛋白，用FITC荧光标记ChHSP70调控序列核心区片段（-304到+72，长376 bp），将两者用于EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay）研究，结果表明 ChDSP1与 ChHSP70的启动子区片段可以结合，经过热竞争和冷竞争实验进一步肯定两者结合具有特异性。 通过细胞体外过表达分析，发现转染后无ChDSP1蛋白表达的对照组，其ChHSP70报告基因在0-6 h期间显著高表达（p＜0.05），在12 h-72 h出现极显著高表达（p＜0.01）；而实验组在ChDSP1蛋白过表达情况下，ChHSP70报告基因的表达受抑制。表明在ChDSP1蛋白存在的条件下，ChHSP70的表达受到明显抑制。 在 mRNA水平用 qRT-PCR方法检测发现 ChDSP1相对于 ChHSP70的表达存在滞后性：将近江牡蛎热休克（37℃）1 h后，在其恢复过程中，检测鳃组织中的ChHSP70和ChDSP1的mRNA水平，发现ChHSP70高表达峰值出现在6 h左右，而ChDSP1高表达峰值出现在12 h左右，相对于ChHSP70的表达，ChDSP1的表达出现滞后性；同样，不同浓度的CdCl2、壬基酚（NP）和三丁基锡（TBT）持续处理近江牡蛎，其鳃组织中ChDSP1的mRNA高表达峰值总是出现在ChHSP70的mRNA峰值后。这些再一次验证了ChDSP1蛋白的负调控作用。 本文首次鉴定出ChHSP70基因的负调控转录因子ChDSP1，对完善ChHSP70基因表达调控机制有重要意义。