GALC基因慢病毒构建高表达β-半乳糖苷酶成纤维细胞衰老模型与结肠癌细胞相互作用的初步研究

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目的了解及进一步明确结直肠癌肿瘤微环境中衰老肿瘤间质细胞与上皮肿瘤细胞间的相互作用。方法1.回顾性分析了采用卡培他滨联合奥沙利铂方案进行新辅助化疗的结直肠癌患者16例,采用免疫组化法观察病理组织标本的肿瘤间质比、间质β-半乳糖苷酶活性、P53、Villin、Ki67、E-cadherin的表达,同时进行生存分析及化疗不良反应的观察。2.采用慢病毒载体转染构建高表达GALC基因(半乳糖苷酶基因)人胚胎肺成纤维细胞(HFL1),以及运用过氧化氢诱导HFL1细胞衰老。3.高表达GALC基因HFL1细胞的相关衰老方面指标的检测:运用免疫组织化学法进行β-半乳糖苷酶染色;PI法细胞周期检测;qRT-PCR及Western-blot法进行p16基因、p21基因、p53基因的表达,qRT-PCR法进行端粒酶蛋白催化亚基(TERT)mRNA的表达。4.将结肠癌细胞株与高表达GALC基因HFL1细胞共培养,采用CCK8法检测结肠癌细胞株细胞活力;碘化丙啶法对结肠癌细胞株细胞周期检测;TransWell法检测结肠癌细胞株迁移能力。结果1.采用Xelox方案新辅助化疗局部晚期结直肠癌患者,16例患者中客观缓解率为25.00%,疾病控制率为68.75%,中位总生存时间为12.00月,无进展生存期为13.43±6.10月。出现III—IV度不良反应分别为手足综合征6.25%、腹泻6.25%、中性粒细胞减少12.50%,贫血为6.25%。化疗后肿瘤间质比提高率为37.50%(6例),间质β-半乳糖苷酶染色表达为强阳性率为37.50%(6例)。化疗后间质β-半乳糖苷酶染色表达阳性与生存相关。2.慢病毒载体转染构建高表达GALC基因HFL1细胞可稳定转染,细胞形态具有衰老间质细胞表现,与过氧化氢诱导HFL1细胞衰老形态相似。3.高表达GALC基因HFL1细胞β-半乳糖苷酶染色呈阳性表现,细胞周期GO/G1期细胞比例明显增多;p21基因mRNA较正常HFL1细胞升高,TERTmRNA明显下降,并且具有统计学差异;p16及p21基因的蛋白表达较正常HFL1细胞明显增加。4.与高表达GALC基因HFL1细胞共培养条件下,LOVO细胞活力明显增加,有统计学差异;共培养24小时及48小时后, LOVO细胞的G0/G1期的比例均明显降低同时G2/M期的比例升高;RKO细胞的迁移能力增强,有统计学差异。结论1.采用Xelox方案新辅助化疗局部晚期结直肠癌患者,疗效可靠,不良反应可以耐受,化疗后间质β-半乳糖苷酶染色表达阳性与生存相关。2.慢病毒载体转染构建高表达GALC基因HFL1细胞可稳定转染,并且具有衰老细胞的相关形态及分子生物学特征。3.高表达GALC基因HFL1细胞与结肠癌细胞株共培养,可影响结肠癌细胞株的细胞周期、细胞活力及细胞迁移能力。
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