金耳多糖的提取、分离和纯化及抗氧化活性的研究

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金耳(Tremella aurantialba)是一种食药兼具、疗效特殊的大型名贵真菌,具有丰富的营养价值和广泛的药理作用,是“三耳”(金耳、银耳、黑木耳)中的佼佼者。金耳多糖是金耳的主要活性成分之一,具有抗肿瘤、降血糖、防治高脂血症和抗氧化等多种药理活性。因此,金耳多糖具有广阔的开发价值和应用潜力。目前对于金耳产品的利用还处于低级粗放阶段,主要以传统的直接食用子实体为主。虽然国内外学者对金耳多糖已经开展了一些研究,但与其他真菌多糖相比,还不够深入。本研究以野生金耳子实体为研究对象,首先,采用热水提取、超声提取、纤维素酶提取和微波提取四种方法,获得4种多糖(分别命名为H-TAP、U-TAP、E-TAP和M-TAP),以多糖得率及抗氧化活性作为筛选依据,优化出金耳多糖的最佳提取方式为酶辅助提取法。通过单因素及正交试验设计优化出了对金耳多糖得率影响最大的酶为纤维素酶,然后采用正交试验和响应面试验对提取条件进行了优化,得出了纤维素酶提取金耳多糖的最佳提取条件,并对四种提取方法所得金耳多糖的结构进行了初步分析,最后采取乙醇分级的方法对金耳多糖进行分离纯化,并对各组分进行了结构分析和抗氧化活性测定,获得了最优活性部位。本论文主要的研究方法及结论如下:4种方法制备的4种多糖H-TAP、U-TAP、E-TAP和M-TAP的提取得率和DPPH自由基清除活性的高低顺序相同,均为E-TAP>U-TAP>H-TAP>M-TAP。综合考虑多糖得率和抗氧化活性,酶辅助提取法均为最高,因此,酶提是金耳多糖的最优制备方法。采取单因素和正交试验L9(3)3对复合酶提取金耳多糖进行了优化。结果表明,在纤维素酶、木瓜蛋白酶和果胶酶中,3种酶对多糖得率影响顺序为:纤维素酶>木瓜蛋白酶>果胶酶,由此看出,纤维素酶对多糖得率影响最为显著。采用正交试验L9(3)4对酶提工艺条件进行了优化,结果表明,各因素对得率顺序的影响为:酶解温度>反应pH>酶解时间>料液比。在上述试验结果基础上,采用Box-Behnken响应面优化了纤维素酶提工艺条件。结果发现,最优工艺为:酶解温度50.93℃,酶解时间60 min,料液比1:80(g/mL),酶加量6.7%(w/w),pH 3.51。在此条件下,金耳多糖的提取得率为25.96%。采用高效阴离子交换色谱法(HPAEC-PAD)和傅立叶变换红外光谱法(FT-IR)对4种提取方法所得的多糖进行化学组成和结构表征的分析。4种多糖含有相似的单糖组分(主要组分含量高低顺序均为:D-甘露糖>D-木糖>D-葡萄糖,且均为含有D-葡萄糖醛酸的酸性多糖),但其摩尔比有明显不同。采用乙醇分级法对金耳多糖进行了分离纯化,获得3种多糖TAP30、TAP60和TAP80,并对其结构进行了表征及抗氧化活性测定。TAP和3种多糖均有一定的抗氧化活性。DPPH自由基清除能力顺序为:TAP30>TAP>TAP60>TAP80,羟基自由基清除能力顺序为:TAP30>TAP60>TAP>TAP80。因此,3种多糖,尤其是TAP30,是一种具有开发前景的多糖组分。
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