一、研究目的:前列腺癌是男性生殖系最常见的恶性肿瘤,据报道仅次于肺癌,在男性是癌症死亡的第二位。它在临床上表现为异种多病灶,近年来发病率有所增加。影响前列腺癌进展和预后的机制涉及一个多步骤的过程,前列腺癌需要新颖有效的诊断和预后生物标志物,用来预防无症状前列腺癌的过度治疗以及确保恶性进行性肿瘤在早期检测阶段能得到及时治疗。NOB1由NOB1基因编码,是26s蛋白酶体一个亚基并且在蛋白讲解途径中发挥着关键的作用。NOB1蛋白包括一个PIN区域和一个碳端锌带域,NOB1据报道成具有转录调控因子作用,可能在细胞周期进展、耐药性以及肿瘤形成中发挥作用。最近的一项研究显示,敲除NOB1基因的表达能够抑制人类神将胶质瘤细胞的增殖和转移,这个结果表明,NOB1能够促进神经胶质瘤细胞的生长和转移,因此NOB1可以作为候选的分子水平设计的靶点。这些因素揭示了NOB1可能参与了多种肿瘤的发生,可能是一个致癌因素。然而,NOB1的表达和它在前列腺癌中的重要性尚未确定。在本研究中,我们研究了NOB1的表达以便评估它在前列腺癌患者长期随访数据预后的重要性以及它与前列腺癌临床病理特点的关系。为了进一步验证NOB1介导前列腺癌侵袭性转变的作用,在前期工作中构建了靶向沉默NOB1基因的shRNA慢病毒,并检测了NOB1消减后的前列腺癌细胞功能表型的改变。MTT实验和克隆形成实验结果表明,下调前列腺癌细胞内源性NOB1的表达后,肿瘤细胞的增殖能力和体外致瘤能力都受到了抑制。Transwell实验证实,前列腺癌细胞的转移能力在NOB1沉默后大幅降低。通过临床标本检测发现,NOB1表达水平与前列腺癌及转移性前列腺癌明显相关。因此我们猜测,前列腺癌细胞癌变过程中,NOB1的表达特异性地上调,随后促进前列腺癌细胞向高侵袭性恶变,这种作用与其在前列腺癌细胞中介导恶性转移等生物学功能密切相关。二、研究内容及结果:（一）NOB1 mRNA、蛋白在前列腺癌组织中表达水平为了了解NOB1在前列腺癌细胞中的作用,前期将利用免疫组化分析前列腺癌组织及邻旁正常组织中NOB1蛋白的表达情况。和正常邻旁组织相比,癌组织表现出着强烈着色现象。利用实时荧光定量基因扩增检测技术和Western blot技术检测32对前列腺癌组织中NOB1 mRNA和蛋白水平,结论是NOB1的基因及蛋白水平在前列腺癌组织中较邻旁组织明显高表达。此外,利用q-pcr技术检测NOB1在前列腺癌组织及其各细胞系中的表达情况,结果显示:NOB1在前列腺癌组织中表达上调,在伴随转移患者的前列腺癌组织中表达水平高于无转移患者的前列腺癌组织;在高恶性程度的前列腺癌细胞中的表达水平要明显高于在低恶性程度的前列腺癌细胞（LNCap）。以上结论提示:NOB1与前列腺癌的发生及恶性侵袭转移密切相关。（二）NOB1-RNAi和回复突变克隆慢病毒载体构建慢病毒载体系统能稳定、高效地将目的基因导入哺乳动物的原代或肿瘤细胞系,且可以在体内长期稳定的表达,受免疫、内环境等影响小,安全性较高等优点。首先根据文献报道及Genebank查询的相关基因序列,合成特异性引物（带酶切位点）,real-time PCR技术对目的基因片段进行扩增,RT-PCR产物双酶切及载体酶切后连接到pCDH体系中,经过阳性质粒转染细胞、慢病毒的获得、浓缩及滴度测定,通过荧光显微镜成像得出我们构建的高滴度的下调NOB1基因的慢病毒载体（shRNA慢病毒载体）。载体感染PC-3和DU-145两种前列腺癌细胞,然后利用PCR技术进行检测,shRNA慢病毒载体明显下调了两种癌细胞中NOB1的表达。以上实验为后续NOB1表达水平对两种前列腺癌细胞肿瘤生物学特性的影响奠定了基础。（三）沉默NOB1对PC-3和DU145前列腺癌细胞的生长增殖、细胞周期及细胞迁移能力的影响前期工作中,我们成功构建了沉默NOB1基因的慢病毒载体,并通过其研讨NOB1与前列腺癌肿瘤细胞之间联系。如前所述,PC-3和DU145两种前列腺癌细胞株具有代表性,我们对经Lv-shNOB1转染后的PC-3和DU145细胞进行MTT实验。和对照组相比,实验组两种癌细胞的生长增殖受到明显抑制。由于细胞周期各阶段所含DNA量不同,可以利用流式细胞技术来分析NOB1基因在前列腺癌细胞周期进程中所起的作用。相对对照组,实验组的PC-3和DU145前列腺癌细胞在G0/G1期发生生长阻滞现象。其中我们还发现,两种癌细胞比例在细胞周期S期明显下降。该实验提示我们,沉默NOB1基因会对细胞周期进程产生影响,从而对前列腺癌细胞的生长增殖产生抑制作用。另外,为了研究NOB1对前列腺癌细胞迁移能力的影响,我们还设计了细胞迁移实验,经过过敲减NOB1基因,两种前列腺癌细胞PC-3和DU145的迁移能力受到明显抑制。三、结论:为进一步了解NOB1在前列腺癌中的功能作用,我们首先利用相关技术分析前列腺癌细胞中NOB1的表达水平,发现NOB1 mRNA、蛋白在前列腺癌细胞组织中明显高表达。接着构建下调NOB1的慢病毒载体,并感染两种前列腺癌细胞株PC-3和DU145,对其进行细胞增殖、细胞周期及细胞迁移等实验,结果显示沉默NOB1基因会致前列腺癌细胞的细胞周期发生细胞生长阻滞现象,并且可以抑制其细胞的增殖生长及迁移能力。因此我们猜测,前列腺癌细胞癌变过程中,NOB1的表达特异性地上调,随后促进前列腺癌细胞向高侵袭性恶变,这种作用与其在前列腺癌细胞中介导恶性转移等生物学功能密切相关。