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烟草是一种对光照和温度要求都非常严格的喜光喜温作物,为了降低烟草品种对光照和温度的敏感性,扩大烟草品种的光温适应范围和种植区域。本研究克隆了烟草光敏色素（NtPHYs）基因,采用生物信息学分析的方法预测了NtPHYs基因在烟草上的功能,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术创制了基因敲除突变体,分析了NtPHYs基因对烟株生长以及对烟草种子和烟苗光温敏感性的影响。主要结果如下:1.推测烟草NtPHYs基因与番茄SlPHYs基因可能具有相似的功能经过普通PCR扩增后得到烟草光敏色素NtPHYs基因全长,PHYA基因全长为2530 bp,PHYB基因全长为3745 bp,PHYC基因全长3665 bp,PHYD基因全长为3945 bp,PHYE基因全长为3461 bp;对其进行生物信息学分析,分析结果表明:烟草NtPHYs与番茄SlPHYs基因的亲缘关系最近,同源性达93%以上,与拟南芥、油菜、水稻、玉米等同源性为60%～80%;其功能结构域主要包括1个发色团结合区GAF（cGMP-specific and-stimulated phosphodiesterase、Anabaena adenylyl cyclases and-Escherichia coil FhlA）结构域,2个PAS（Per-Art-Ser）结构域,1个组氨酸激酶A结构域（HisKA）与1个类似组氨酸激酶的ATP激酶结构域（HATPase＿c）。此外,除PHYE外,其余四个基因还包含一个PAC结构域;理化性质分析结果预测其分子量在124.30～127.52kDa,是一种酸性与亲水性蛋白,与番茄SlPHYs的理化性质极为相似。因此推测两者存在相似的功能。2.获得烟草NtPHYs基因的转化突变株使用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了光敏色素的五个单基因敲除载体,然后用农杆菌浸染的方法进行遗传转化得到转化株。后经Cas9和潮霉素Hyg基因进行检测分别得到PHYA阳性突变株5株,PHYC阳性突变株5株,PHYD阳性突变株5株,PHYE阳性突变株5株。之后用靶位点两侧特异性引物进行PCR扩增然后对PCR产物进行酶切,将酶切产物送至公司测序,对于测序结果出现双峰,不能确定突变性质的阳性株进行Ta亚克隆并对结果进行分析。结果显示:各突变株均为靶向突变,其中PHYA突变株有4株为单条染色体突变,1株为两条染色体突变,5株突变株均产生了移码突变,从而导致蛋白质水平的变化;PHYC突变株有3株为单条染色体突变,2株为两条染色体的突变,5株突变株均产生了移码突变,从而导致了蛋白质水平的变化;PHYD突变株有2株为单条染色体突变,3株为两条染色体突变,其中有两株产生了多碱基缺失,导致终止密码子TAG的提前产生,蛋白合成提前终止,5株突变株均导致了蛋白质水平的变化;PHYE突变株5株均为单条染色体突变,其中两株突变后蛋白编码的氨基酸并未发生变化,为无效突变。另外3株突变株均导致了蛋白质水平的变化。对阳性突变株的表达量测定结果表明,除产生无效突变的PHYE-3与PHYE-4突变株与野生型表达量无显著差异外,各突变株的基因表达量都显著低于野生型,此结果更进一步说明经Cas9编辑后,突变株发生了基因序列、蛋白水平及基因表达水平上的改变,产生了突变效应,突变株可用于后期基因功能的鉴定。3.烟草NtPHYs基因改变了烟株的表型对T1代突变株光合色素含量、光合特性相关指标与农艺性状进行测定。测定结果显示,PHYA、PHYC与PHYD突变株的叶绿素含量显著高于野生型,PHYA与PHYD突变株的类胡萝卜素含量显著高于野生型;各突变株系的光合特性指标都显著高于野生型;PHYA与PHYC突变株的综合农艺性状最好,各指标都显著高于野生型。可以看出,敲除NtPHYs基因能增加烟草光合色素含量、提高光合效率、促进烟株的生长。4.突变株对光温的敏感性发生改变对T1代种子和幼苗进行不同光温胁迫处理后统计种子萌发率与叶片中基因的表达量,结果表明在几个不同光温处理条件下,各突变体种子萌发率都显著高于野生型。叶片中基因的表达量也比野生型的高;对低温胁迫处理后的突变株过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）与过氧化氢酶（CAT）含量测定结果显示:PHYA与PHYD突变株的POD、SOD与CAT含量显著高于野生型。由此可以看出NtPHYs基因调控了烟草种子及烟株对光温的敏感性,提高了对逆境的抵抗能力,拓宽了烟草的光温适应范围和种植区域。本研究通过CRISPR/Cas9基因编辑技术获得阳性突变株,通过对阳性突变株功能鉴定,发现突变株的光合色素含量、光合特性指标及农艺性状指标都要优于对照。且在光温胁迫下,突变株的种子萌发率及叶片中的基因表达量都要高于野生型。此外,在低温胁迫下,突变株的相关酶活性也都高于野生型。由此可以看出来,烟草NtPHYs基因具有调控光温敏感性、促进烟草生长、增强低温抗性的功能。研究结果为解析NtPHYs基因对烟草生长发育的调控机理提供了理论参考和研究材料,对光温低敏感性烟草品种的选育具有重要的实践意义。