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异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)突变是肿瘤最常见的遗传学改变之一，IDH1突变体与NADPH之间的结合能力增强，能够将α-酮基戊二酸(α-ketoglutarate，α-KG)还原为D-2-羟基戊二酸(D-2-hydroxyglutarate，D-2HG)，其还可以抑制α-KG所依赖的酶促反应，导致表观遗传学的改变，并且与肿瘤的恶性过程密切相关。近来越来越多的研究认为，IDH突变参与了肿瘤代谢重编程，但其具体作用仍有待深入研究。作为主要代谢物，脂肪酸(fatty acid，FA)是合成细胞膜磷脂的基本原料，脂肪酸氧化(fatty acid oxidation，FAO)也为肿瘤细胞的生长提供NADPH和ATP。此外，FAO还是线粒体产生活性氧簇(reactive oxygen species， ROS)的重要来源，大量的ROS能够直接影响生物大分子的功能，包括DNA、脂质和蛋白质，最终导致细胞恶性转化和肿瘤发生。然而，IDH突变对脂质代谢的具体影响目前仍知之甚少。
另一方面，IDH突变靶向抑制剂已成为相关肿瘤药物研发领域最具潜质的研究内容，国内外多个IDH突变体的靶向抑制剂正处于不同研究阶段。IDH突变体靶向抑制剂最近在急性髓系白血病(acute myelocytic leukaemia，AML)的治疗上取得了突破性进展，因此寻找和确定新型IDH突变体抑制剂已成为目前研究的热点。
本课题首先研究了IDH1突变对肿瘤细胞中FA诱导氧化应激的影响，然后在来源于中药的小分子化合物中，筛选出一种IDH1(R132H)突变体的潜在靶向抑制剂，最后对其进行了初步的功能研究和安全性分析，为认识IDH1突变的代谢功能和相关肿瘤治疗提供了实验基础。
1.IDH1突变对HCT116细胞中FA诱导氧化应激的影响
我们采用不同浓度的油酸(oleic acid，OA)和棕榈酸(palmitic acid，PA)对野生型和IDH1(R132H)突变型HCT116细胞进行了处理。结果发现，IDH1突变增加了高浓度(400μM)FA诱导的细胞生长抑制和凋亡；在此基础上，我们进一步对相关氧化应激指标进行评估，结果发现，IDH1突变细胞中的ROS和脂质过氧化产物均明显升高，这些结果表明，IDH1突变加剧了高浓度FA诱导的细胞氧化应激；另外，IDH1突变能够增加细胞中脂质的蓄积，但抑制了细胞内的FAO；除此之外，我们还发现IDH1突变促进了细胞对葡萄糖的消耗；基于IDH1突变细胞中升高的ROS水平和降低的FAO速率之间的矛盾，我们推测IDH1突变影响了线粒体的数量和/或功能，因此我们进一步检测了线粒体呼吸链的重要组成部分以及三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle，TCA Cycle)循环中的关键酶的mRNA及蛋白表达水平。结果表明，IDH1突变显著降低了HCT116细胞中的细胞色素C(cytochrome c，CYCS)和细胞色素C氧化酶亚单位Ⅳ(cytochrome c oxidase subunit 4，Cox4)的表达，而TCA循环中的关键酶没有出现明显的变化，这表明IDH1突变导致了细胞线粒体呼吸链的损伤。
2.IDH1(R132H)靶向抑制剂的筛选和初步鉴定
结合我国丰富的中药资源，通过计算机辅助药物设计(computer-aided drug design，CADD)我们首次在来源于中药的小分子化合物中，初步筛选出16个突变型IDH1(R132H)潜在的靶向抑制剂小分子；结合这些小分子在酶促反应中对IDH1(R132H)突变体的抑制效果，及其对IDH1(R132H)突变细胞产生D-2HG的抑制效果，我们最终鉴定出一种最有效的IDH1(R132H)靶向抑制剂——ZINC0397XXXX，已有研究表明，其为葛杜宁，是一种天然苦味剂，也是中药苦楝皮内提取的有效成分之一。
3.IDH1(R132H)靶向抑制剂对肿瘤细胞氧化应激的影响及初步安全性分析
我们首先利用酶活性抑制检测法，确定了该小分子抑制剂对IDH1(R132H)突变体的IC50为66.99nM；质谱分析结果显示，该小分子抑制剂能够减少IDH1(R132H)突变细胞内及其培养液中D-2HG的水平，并存在剂量依赖关系；同时，我们发现该小分子能够明显减少FA诱导的IDH1(R132H)突变细胞的ROS生成；最后，通过动物实验，我们发现较高浓度的该小分子抑制剂对小鼠体重没有显著影响，且对重要器官的组织结构亦无明显损伤，表明该小分子抑制剂具有较好的安全性，为进一步研究提供了基础。
综上所述，本课题首先明确了IDH1突变造成细胞中线粒体功能损害，进而加重了FA诱导的氧化应激；然后初步筛选出16个IDH1(R132H)突变体的潜在靶向抑制分子，并最终确定出一种最有效的抑制剂小分子；最后对该小分子进行了初步的功能研究和安全性评价，明确其能够抑制IDH1(R132H)突变细胞生成D-2HG，并能够减少FA诱导的IDH1(R132H)突变细胞的氧化应激，且具有较好的安全性。本研究不仅对理解IDH1突变在肿瘤氧化应激和代谢重编程中的作用具有重要意义，而且为IDH1突变型肿瘤的靶向治疗提供了潜在药物。
另一方面，IDH突变靶向抑制剂已成为相关肿瘤药物研发领域最具潜质的研究内容，国内外多个IDH突变体的靶向抑制剂正处于不同研究阶段。IDH突变体靶向抑制剂最近在急性髓系白血病(acute myelocytic leukaemia，AML)的治疗上取得了突破性进展，因此寻找和确定新型IDH突变体抑制剂已成为目前研究的热点。
本课题首先研究了IDH1突变对肿瘤细胞中FA诱导氧化应激的影响，然后在来源于中药的小分子化合物中，筛选出一种IDH1(R132H)突变体的潜在靶向抑制剂，最后对其进行了初步的功能研究和安全性分析，为认识IDH1突变的代谢功能和相关肿瘤治疗提供了实验基础。
1.IDH1突变对HCT116细胞中FA诱导氧化应激的影响
我们采用不同浓度的油酸(oleic acid，OA)和棕榈酸(palmitic acid，PA)对野生型和IDH1(R132H)突变型HCT116细胞进行了处理。结果发现，IDH1突变增加了高浓度(400μM)FA诱导的细胞生长抑制和凋亡；在此基础上，我们进一步对相关氧化应激指标进行评估，结果发现，IDH1突变细胞中的ROS和脂质过氧化产物均明显升高，这些结果表明，IDH1突变加剧了高浓度FA诱导的细胞氧化应激；另外，IDH1突变能够增加细胞中脂质的蓄积，但抑制了细胞内的FAO；除此之外，我们还发现IDH1突变促进了细胞对葡萄糖的消耗；基于IDH1突变细胞中升高的ROS水平和降低的FAO速率之间的矛盾，我们推测IDH1突变影响了线粒体的数量和/或功能，因此我们进一步检测了线粒体呼吸链的重要组成部分以及三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle，TCA Cycle)循环中的关键酶的mRNA及蛋白表达水平。结果表明，IDH1突变显著降低了HCT116细胞中的细胞色素C(cytochrome c，CYCS)和细胞色素C氧化酶亚单位Ⅳ(cytochrome c oxidase subunit 4，Cox4)的表达，而TCA循环中的关键酶没有出现明显的变化，这表明IDH1突变导致了细胞线粒体呼吸链的损伤。
2.IDH1(R132H)靶向抑制剂的筛选和初步鉴定
结合我国丰富的中药资源，通过计算机辅助药物设计(computer-aided drug design，CADD)我们首次在来源于中药的小分子化合物中，初步筛选出16个突变型IDH1(R132H)潜在的靶向抑制剂小分子；结合这些小分子在酶促反应中对IDH1(R132H)突变体的抑制效果，及其对IDH1(R132H)突变细胞产生D-2HG的抑制效果，我们最终鉴定出一种最有效的IDH1(R132H)靶向抑制剂——ZINC0397XXXX，已有研究表明，其为葛杜宁，是一种天然苦味剂，也是中药苦楝皮内提取的有效成分之一。
3.IDH1(R132H)靶向抑制剂对肿瘤细胞氧化应激的影响及初步安全性分析
我们首先利用酶活性抑制检测法，确定了该小分子抑制剂对IDH1(R132H)突变体的IC50为66.99nM；质谱分析结果显示，该小分子抑制剂能够减少IDH1(R132H)突变细胞内及其培养液中D-2HG的水平，并存在剂量依赖关系；同时，我们发现该小分子能够明显减少FA诱导的IDH1(R132H)突变细胞的ROS生成；最后，通过动物实验，我们发现较高浓度的该小分子抑制剂对小鼠体重没有显著影响，且对重要器官的组织结构亦无明显损伤，表明该小分子抑制剂具有较好的安全性，为进一步研究提供了基础。
综上所述，本课题首先明确了IDH1突变造成细胞中线粒体功能损害，进而加重了FA诱导的氧化应激；然后初步筛选出16个IDH1(R132H)突变体的潜在靶向抑制分子，并最终确定出一种最有效的抑制剂小分子；最后对该小分子进行了初步的功能研究和安全性评价，明确其能够抑制IDH1(R132H)突变细胞生成D-2HG，并能够减少FA诱导的IDH1(R132H)突变细胞的氧化应激，且具有较好的安全性。本研究不仅对理解IDH1突变在肿瘤氧化应激和代谢重编程中的作用具有重要意义，而且为IDH1突变型肿瘤的靶向治疗提供了潜在药物。