一嗜热脱氮土壤芽胞杆菌NG80-2长链烷烃羟化酶LadA的体外定向进化　　 嗜热脱氮土壤芽胞杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)NG80-2，分离于我国大港油田，是一株能降解长链(C15-C36)烷烃的嗜热菌(最适生长温度为65℃)。在深层油藏的高温缺氧条件下，它能够利用原油为唯一碳源和能量来源，很好的生长。可用于改善原油流动性及降低重/轻质烷烃的比例。　　 NG80-2长链烷烃代谢途径中最关键酶是第一步的长链烷烃羟化酶基因　　 (ladA)。通过末端单加氧的方式，该酶能够催化长链烷烃(C15-C36)生成相对应的伯醇。该酶是目前能催化最长碳链的高温氧化酶，也是目前能催化长链烷烃最有用的酶之一。因此，LadA在石油污染治理中具有巨大的应用前景。本实验室前期对LadA蛋白进行了基因的克隆和表达鉴定，进行了酶学性质研究，并对其三维结构进行了x射线衍射分析。　　 为进一步提高LadA催化长链饱和烷烃生成相对应伯醇的活性，本论文采用体外随机突变的易错PCR方法与定点饱和突变相结合的定向进化策略，以LadA野生型蛋白作为亲本，进行定向进化。通过建立合适的高通量筛选方法，最终获得了9个具有较高活性的突变酶。对这些突变酶的酶学性质进行了分析，同时对突变酶活性改变的机制与分子结构之间的联系进行了较系统的研究。　　 建立以E coli DH5α收集突变文库及E.coli BL21表达LadA，基于NADPH消耗的96孔板高通量筛选方法。采用易错PCR随机突变方法对ladA进行突变。通过优化实验中模版量和循环次数，将突变率控制在2-4bp/基因。建立了5个平行的突变文库，通过筛选7500个突变体，得到了3个酶活提高的突变酶(A102D，L320V和F146C/N376I)。在得到的3个突变酶4个突变位点的基础上，对这4个位点进行拆分及组合，构建了6个新酶，通过检测酶活来评估这些位点之间的相互作用。采用定点饱和突变方法对以上4个氨基酸残基及计算机预测突变“热点”114位氨基酸残基进行饱和性分析。通过测序得到了5个位点的所有氨基酸突变酶。对这些突变酶进行活性分析，得到6个高于亲本酶活性的新酶(A102E，L320A，F146Q/N376I，F146E/N376I，F146R/N376I，F146N/N376I)。对这9个突变酶(A102D，A102E，L320V，L320A，F146Q/N376I，F146E/N376I，F146R/N376I，F146N/N376I和F146C/N376I)进行基本酶学性质分析。实验结果表明，与野生型LadA相比，突变酶活性(kcat)提高2-3.4倍，其中F146N/N376I具有最高活性；催化效率(kcat/Km)提高了1.9-12.7倍，其中F146E/N376I和A102E提高最多。对突变酶的最适反应温度，最适反应pH，热稳定性及底物范围等酶学性质进行了研究。表达LadA突变体的Pseudomonas fluorescens KOB2A1菌株比表达LadA野生型酶的KOB2A1菌株在以十六烷为唯一碳源和能量来源的培养基中生长快，从而在体内验证了LadA突变体的活性。对通过易错PCR技术得到的3个突变酶进行氨基酸置换。运用计算机模拟进行同源模建，进一步研究了酶活性提高与结构变化之间的关系。本研究得到的突变体在石油污染治理和原油开发等生物过程中具有很大的应用潜力。　　 二长链脂肪酸辅酶A连接酶Facl的功能鉴定　　 本研究对NG80-2长链烷烃降解途径中第四步的两个长链脂肪酸辅酶A连接酶(Facll和Facl2)基因GTNG_0892和GTNG_1447进行了克隆表达和体外功能鉴定。Facl1在大肠杆菌中的表达产物分别为同二聚体，Facl2在大肠杆菌中的表达产物为非球状单体或同二聚体。Facl2和Facl2均可以催化C2到C30的脂肪酸，Facl1的最适底物是癸酸，Facl2的最适底物是棕榈酸。Facl1和Facl2最适反应温度为均为60℃，最适反应pH均为7.5，且需要ATP作为辅因子。对Facl1和Facl2的热稳定性进行了分析。同时分析了金属离子，EDTA，SDS和Triton X-100对酶活的影响。实时定量PCR显示，当NG80-2在以原油为唯一碳源的培养基中生长时，facl1和facl2的mRNA水平发生了上调。本研究对NG80-2中其余5个Facl酶也进行了克隆表达和功能鉴定。发现这5个Facl酶不能降解链长超过C14的脂肪酸，因此，可以确定Facl1和Facl2催化长链烷烃降解途径中第四步反应。这是在细菌中首次发现并鉴定的能够催化链长到至少C30的长链脂肪酸辅酶A连接酶。