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背景: 支气管哮喘(简称哮喘)是最常见的儿童时期慢性呼吸道疾病之一,它是由多种细胞及细胞组分参与的非特异性慢性气道炎症性疾病,气道炎症和气道重塑是哮喘的主要病理特征.目前全球范围内约有3亿哮喘患者,其中儿童发病率约占总发病率的一半,且哮喘发病率仍呈现上升趋势.哮喘目前已成为严重的公共卫生问题,因此对哮喘发病机制和治疗方式的进一步研究迫在眉睫. 哮喘体内存在着多种信号转导机制,PI3K/AKT 信号通路参与调节机体的生长、发育、代谢等功能.配体与细胞表面生长因子受体结合后激活 PI3K,活化的PI3K进一步激活AKT.mTOR是丝氨酸/苏氨酸激酶,依赖PI3K/AKT信号通路而活化.PI3K/AKT/mTOR信号通路在调节机体细胞增殖、生长、分化等发挥重要作用.胰岛素样生长因子( IGF )与其相应的胰岛素样生长因子受体(IGF1R)结合后使PI3K自动磷酸化,激活PI3K/AKT/mTOR信号通路,引起机体一系列细胞活动. MicroRNA(miRNA)属于内源基因编码的小片段RNA,通过靶向结合mRNA基因片段,参与mRNA的转录或蛋白质翻译过程.miRNA参与器官的形成、机体生长发育与死亡、疾病的发生和发展等病理生理过程.研究发现在多数疾病中存在miRNA表达失调,因此随着对miRNA深入研究,将帮助我们更加清楚的了解疾病的基因组复杂的基因表达调控网络.在哮喘发病机制中,miRNA 主要通过对多条信号通路的调节参与哮喘的病理生理过程.现已证实 miR-155、miR-146a、miR-150、let-7家族等都参与了对哮喘的调控,miR-133a可以作为支气管平滑肌细胞中RhoA蛋白表达的内源性调节剂,但是对miR-133a在哮喘气道重塑中的作用鲜有报道. 本研究首先通过模拟哮喘小鼠模型,评估miR-133a哮喘小鼠中差异性表达,其次通过上调或下调原代气道平滑肌细胞内miR-133a表达水平,研究miR-133a在哮喘中的调控机制,为哮喘新的诊断和治疗方法提供理论依据. 第一部分 microRNA-133a 在哮喘中表达的变化及其对哮喘气道重塑的影响 目的： 制作哮喘小鼠模型,评估miRNA-133a在哮喘小鼠中的表达差异及其对哮喘气道重塑的影响. 方法： 40只3-4周龄Balb/c雌性小鼠随机分为:(1)正常组10只;(2)哮喘组10只;(3)miR-133a上调哮喘组(Ad-miR-133a)10 只;(4)miR-133a下调哮喘组(Ad-miR-133a sponge)10只.哮喘组、Ad-miR-133a组、Ad-miR-133a sponge组用OVA/Al(OH)3致敏,5%OVA溶液激发造成哮喘模型,Ad-miR-133a组和Ad-miR-133a sponge组在致敏前和致敏后分别以携带miR-133a上调和下调基因的腺病毒气管内滴入模拟miR-133a上调和miR-133a下调哮喘小鼠模型,正常组均予以生理盐水替代.最后一次OVA激发后24h内,光镜下检测肺组织改变,肺功能仪测定四组小鼠气道反应性变化, ELISA 法检测四组小鼠肺泡灌洗液(BALF)和血清中 IL-13、IL-5 含量,免疫组化检测肺组织支气管平滑肌层变化,Western bloting(WB)检测AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、p-p70S6k、α-SMA等蛋白含量变化,qRT-PCR检测miR-133a和α-SMA mRNA变化. 结果： 1. 光镜 HE切片染色显示Ad-miR-133a sponge组血管周围和支气管周围炎症细胞浸润最为明显,聚集成团块状,炎症细胞评分中位数(M)为4分,Ad-miR-133a组较哮喘组明显减轻,炎症细胞散在性浸润,炎症细胞评分中位数(M)为 1.5分,哮喘组支气管周围炎症细胞浸润较正常组明显,炎性细胞呈小团块状,两组炎症细胞评分中位数(M)分别为3分、1.5分,统计学有显著性差异(P<0.01). 2. 气道阻力(Rn)变化 哮喘组、Ad-miR-133a组、Ad-miR-133a sponge组较正常组均显著性增高, Ad-miR-133a sponge组增高最为明显(P<0.05),Ad-miR-133a组较哮喘组明显降低(P<0.01),统计学有显著性差异.随乙酰甲胆碱激发浓度上升,各组小鼠Rn值与其基线值比均逐渐增高,Ad-miR-133a sponge组上升幅度最大, Ad-miR-133a组较哮喘组上升幅度有所降低,正常组无明显变化,统计学有显著性差异(P<0.05). 3. 免疫组化 Ad-miR-133a sponge组肺组织平滑肌层厚度增加最为明显,积分光密度值(IOD)显著性高于其他三组(P<0.01), Ad-miR-133a 组平滑肌层厚度增加不明显,IOD 值低于较哮喘组(P<0.01),哮喘组较 IOD 值较正常组明显增加(P<0.01),统计学有显著性差异. 4.血清和BALF中IL-13、IL-5含量 哮喘组和Ad-miR-133a sponge组血清和BALF中IL-13、IL-5表达明显增高,且Ad-miR-133a sponge组显著性高于哮喘组,Ad-miR-133a组血清和BALF中IL-13、T IL-5较哮喘组明显降低,哮喘组血清和BALF中IL-13、T IL-5含量较正常组明显增高,统计学有显著性差异(P<0.001). 5.WB检测肺组织蛋白变化 正常组、哮喘组、Ad-miR-133a组和Ad-miR-133a sponge组肺组织AKT、mTOR蛋白变化无统计学差异.而Ad-miR-133a sponge组p-AKT、p-mTOR、p-p70s6k及α-SMA蛋白含量明显高于Ad-miR-133a spongeNC组(P<0.01), Ad-miR-133a组明显低于Ad-miR-133 NC组(P<0.01),统计学有显著性差异.哮喘组p-AKT、p-mTOR及α-SMA肺组织蛋白含量显著性高于正常组(P<0.01),统计学有显著性差异. 6.qRT-PCR检测 哮喘组miR-133a含量明显低于正常组(P<0.01),而α-SMA mRNA含量明显高于正常组(P<0.01),统计学有显著性差异.Ad-miR-133a sponge组α-SMA mRNA含量明显高于Ad-miR-133a spongeNC组(P<0.001),而Ad-miR-133a组α-SMA mRNA含量明显低于Ad-miR-133aNC组(P<0.05),统计学有显著性差异. 结论: 1.哮喘小鼠体内miR-133a表达明显低于正常小鼠; 2. miR-133a负性调节哮喘小鼠肺组织内α-SMA表达,缓解哮喘小鼠气道重塑. 第二部分 miR-133a调控PI3K/AKT/mTOR表达改善哮喘气道重塑 第一章 PI3K/AKTmTOR信号通路在哮喘中的作用 目的： 探讨PI3K/AKT/mTOR信号通路在哮喘气道重塑中的作用. 方法： 原代小鼠气道平滑肌细胞(ASMCs)提取与培养,免疫细胞荧光化学法鉴定其纯度;分组为:正常组(正常 ASMCs),哮喘组(哮喘 ASMCs), DMSO组(哮喘ASMCs+DMSO),AKT抑制剂LY294003组(哮喘ASMCs+LY294002), mTOR抑制剂PP242不同浓度组(0.5μmol/ml,1.0μmol/ml,2.0μmol/ml)(哮喘ASMCs+ 不同浓度PP242).WB法检测蛋白AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、p-p70S6k、α-SMA等含量,qRT-PCR法检测α-SMA mRNA含量. 结果： 1. ASMCs生长情况及纯度鉴定 酶消化法提取 ASMCs 生长迅速,差速贴壁法后ASMC 纯度可达到 98%以上,呈现"峰-谷"样生长.免疫荧光法对ASMCs特征性蛋白平滑肌细胞α -肌动蛋白(α-SMA)染色显示, 98%以上细胞染色呈现阳性结果. 2. WB法检测蛋白表达情况 哮喘ASMCs以LY294002干预后,LY294002组p-AKT、p-mTOR、p-p70S6k、α-SMA 蛋白含量明显低于 DMSO 组(P<0.05),而哮喘组均显著性高于正常组(P<0.05),统计学有显著性差异.哮喘ASMcs PP242干预后,随着PP242浓度上升,p-mTOR、p-p70S6k、α-SMA蛋白含量逐渐降低,且均显著性低于DMSO组,哮喘组p-mTOR、p-p70S6k、α-SMA蛋白含量明显高于正常组,统计学均有有显著性差异(P<0.05). 结论： PI3K/AKT/mTOR信号通路正向调节哮喘ASMCs内α-SMA的表达,哮喘气道重塑现象可能与PI3K/AKT/mTOR信号通路激活有关. 第二章 microRNA-133a对PI3K/AKT/mTOR信号通路的调控作用 目的： 探讨miR-133a是否通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路表达参与哮喘气道重塑. 方法： 利用腺病毒转染哮喘 ASMCs,腺病毒携带 Ad-miR-133a 转染哮喘 ASMCs模拟miR-133a上调模型,腺病毒携带Ad-miR-133a sponge基因转染哮喘ASMCs模拟miR-133a下调模型,Ad-miR-133a NC和Ad-miR-133a sponge NC分别作为上调对照和下调对照;分组为正常组(正常ASMCs)、哮喘组(哮喘ASMCs)、哮喘Ad-miR-133a NC组(Ad-miR-133a NC)、哮喘Ad-miR-133a组(Ad-miR-133a)、哮喘Ad-miR-133a sponge NC组(Ad-miR-133a sponge NC)、哮喘Ad-miR-133a sponge组(Ad-miR-133a sponge);应用免疫荧光检测各组细胞中α-SMA变化;应用WB检测气道平滑肌细胞中蛋白AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、p-p70S6k、α-SMA等变化,用用qRT-PCR法检测α-SMA mRNA变化. 结果： 1. 细胞免疫荧光α-SMA表达变化 Ad-miR-133a sponge组免疫荧光强度明显高于Ad-miR-133a sponge NC组,而Ad-miR-133a组免疫荧光强度明显低于Ad-miR-133a NC组,哮喘组免疫荧光强度明显高于正常组,统计学有显著性差异义. 2. WB法检测蛋白表达情况 Ad-miR-133a sponge组p-AKT、p-mTOR、p-p70S6k、α-SMA蛋白含量明显高于Ad-miR-133a sponge NC组,而Ad-miR-133a组p-AKT、p-mTOR、p-p70S6k、α-SMA蛋白含量明显低于Ad-miR-133a NC组,哮喘组p-AKT、p-mTOR、p-p70S6k、α-SMA蛋白含量明显高于正常组,统计学有显著性差异(P<0.05).3.qRT-PCR法检测α-SMA mRNA含量变化 Ad-miR-133a sponge组显著性高于Ad-miR-133a sponge NC组,Ad-miR-133a组显著性低于Ad-miR-133a NC组,哮喘组显著性高于正常组,统计学有显著性差异(P<0.05). 结论： miR-133a负性调控PI3K/AKT/mTOR信号通路表达缓解哮喘气道重塑. 第三部分 miR-133a直接作用于靶基因IGF1R 目的： 探讨miR-133a作用靶目标是否是IGF1R. 方法： 腺病毒转染哮喘 ASMCs,模拟 miR-133a 上调和下调模型,将细胞分为Ad-miR-133a NC组、Ad-miR-133a组、Ad-miR-133a sponge NC组、Ad-miR-133a sponge组,用WB法检测各组IGF1R蛋白含量变化;通过TargetScan和micrrna网站预测miR-133a靶目标;采用双荧光素酶报告基因验证miR-133a靶目标,实验分为 IGF1R-WT+NC 组、IGF1R-WT+miR-133a 组、IGF1R-Mut+NC 组、IGF1R-Mu+miR-133a组,以lip2000共转miRNA mimic和靶基因IGF1R mRNA 3UTR双荧光素酶报告载体质粒,通过萤火虫萤光素酶的活性分析各组荧光值. 结果： 1. WB检测IGF1R蛋白表达变化 Ad-miR-133a sponge组IGF1R蛋白含量明显高于Ad-miR-133a sponge NC组(P<0.001),Ad-miR-133a组IGF1R蛋白含量明显低于Ad-miR-133a NC组(P<0.05),统计学有显著性差异. 2. TargetScan和micrrna网站预测结果 TargetScan和micrrna网站预测miR-133a靶目标为IGF1R mRNA 3UTR. 3. 双荧光素酶法结果 双荧光素酶法通过对萤火虫荧光素酶活性分析,IGF1R-WT+miR-133a组荧光值明显低于IGF1R-WT+NC组,统计学有显著性差异(P<0.001),IGF1R-Mut+NC组和IGF1R-Mu+miR-133a组统计学无显著性差异. 结论： miR-133a直接作用靶目标是IGF1R mRNA 3UTR.