背景鼻咽癌是东南亚地区,尤其是我国南方各省最常见的恶性肿瘤之一,占广东省头颈部肿瘤的首位和全身恶性肿瘤死亡率的第3位。目前放射治疗为鼻咽癌的首选治疗手段,放化综合治疗5年生存率达50%—60%,但即使经过正规根治的放化综合治疗,中晚期鼻咽癌患者的局部复发和远处转移仍然是患者死亡的主要原因,并且再程放化疗的效果不理想,而毒副反应却明显增加,病人生活质量下降。因此,有必要为中晚期鼻咽癌患者提供一种安全有效的二线治疗方法。肿瘤生物治疗随着现代分子生物学技术和肿瘤免疫学的飞速发展不断得到充实与更新,目前已成为继手术、化疗、放疗之后的第四大治疗手段,而被广大医务工作者和患者接受。过继性细胞免疫治疗是肿瘤免疫治疗的一个重要分支,它是通过输注抗肿瘤免疫效应细胞的方法增强肿瘤患者的免疫功能达到抗肿瘤的目的,过继性细胞免疫治疗分为:非特异性免疫治疗(肿瘤患者自体外周血CIK细胞治疗技术)已广泛用于临床,有效率在30%左右,经过CIK细胞治疗技术改良后有效率还可望提高;特异性免疫治疗,是对某种肿瘤细胞有针对杀伤作用的免疫治疗方法,疗效优于非特异性免疫治疗,具有广阔的临床应用前景。EB病毒是一种与多种肿瘤发生发展密切相关的外部致病因子,它在多种肿瘤细胞中存在并且与这些肿瘤的发生发展密切相关,已经证实,鼻咽癌与EB病毒的感染密切相关,该病毒的存在为以细胞毒性T细胞(CTL)为基础的免疫治疗提供了一个潜在靶位,目前许多关于EB病毒相关肿瘤免疫治疗的研究都是针对其表达的抗原LMP2的。但这种特异性的免疫治疗方法,需要在体外培养出大量和高效的特异杀伤性CTL,经过处理后再输入人体进行治疗,传统的PBMC/OKT-3法培养扩增出的EBV特异性CTL存在特异性抗肿瘤免疫反应低下的问题,在CTL数量、活性和稳定性方面均有缺陷,其中一个重要原因是T细胞共刺激分子表达不足或缺陷。CD28和4-1BB是迄今发现的T细胞上两种最重要的共刺激分子,前者表达于静止T细胞,优先诱导CD4+T细胞活性;后者表达于活化T细胞,优先诱导CD8+T细胞活性。它们分别与抗原递呈细胞(APC)上的B7(CD80)和4-1BBL结合,协同MHC-Ag信号,提高肿瘤细胞免疫原性,促进T细胞活化、增殖、分化和凋亡,在T细胞的持续活化过程中发挥重要作用。这种共刺激分子介导的协同刺激通路虽然是非特异性的,但它们在介导免疫反应的过程中相互调节,发挥互补作用,对于T细胞的激活是不可缺少的。因此寻找一种能稳定表达这两种共刺激分子的实验方法,是研究其作为CTL体外扩增系统的基础,也为鼻咽癌及其它肿瘤的免疫治疗提供了条件。实验目的构建和克隆CD28和4-1BB分子的重组质粒,并在白血病细胞(K562)上稳定表达。方法1、培养人白血病细胞(K562)。2、合成人CD28分子的基因序列,亚克隆于pcDNA3.1-Neo构建重组表达载体,并将重组质粒转化大肠杆菌(E.coli DH-5α菌株)。3、合成人4-1BB分子的基因序列,亚克隆于pcDNA3.1-Neo构建重组表达载体,并将重组质粒转化大肠杆菌(E.coli DH-5α菌株)。4、于大肠杆菌内大量扩增和提取CD28和4-1BB重组质粒。5、构建质粒转染的K562细胞。6、筛选转染的K562细胞。7、用流式细胞仪检测CD28和4-1BB在K562细胞上的表达。结果1、合成人CD28分子的基因序列,经DNA序列分析证实合成的基因序列为人CD28编码序列。2、将合成产物与pcDNA3.1-Neo载体相连接得到重组质粒,经酶切电泳结果证实含有目的基因片段(即CD28基因序列)。3、合成人4-1BB分子的基因序列,经DNA序列分析证实合成的基因序列为人4-1BB编码序列。4、将合成产物与pcDNA3.1-Neo载体相连接得到重组质粒,经酶切电泳结果证实含有目的基因片段(即4-1BB基因序列)。5、采用流式细胞仪检测显示有29.54%转染的K562细胞表达共刺激分子CD28。6、采用流式细胞仪检测显示有28.31%转染的K562细胞表达共刺激分子4-1BB。结论本研究表明运用此种实验方法可成功地克隆并在白血病细胞K562上稳定表达共刺激分子CD28和4-1BB,并以此作为CTL体外扩增系统的实验基础。