载STEAP-1抗体超声靶向纳米微泡的制备及其对前列腺癌的体外寻靶能力实验研究

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第一部分前列腺癌细胞的培养及裸鼠前列腺癌移植瘤动物模型的建立目的:培养两种不同类型前列腺癌细胞PC3株和LNCa P株,观察细胞生长状况,并分别种植在BALB/c-nu/nu裸鼠皮下,观察并测量两种癌细胞在裸鼠皮下的成瘤效果。方法:从-80℃冰箱中取出库存的PC3和LNCa P细胞株,经水浴锅快速复温后转移至细胞培养瓶中放置恒温培养箱中培养,待其呈对数生长期时传代并转移至较大培养瓶中继续培养,待大细胞培养瓶中细胞密度较高时计数细胞个数并计算细胞浓度;将一定浓度的细胞悬液种植于提前饲养的裸鼠颈背部皮下,每日观察种植部位变化并每周测量皮下结节大小,四周后记录所有裸鼠移植瘤的大小、称重每只裸鼠体重并计算平均值和标准差。裸鼠麻醉后在超声诊断仪下行二维及彩色多普勒检查。结果:所培养的两种前列腺癌细胞生长良好,且能种植于裸鼠颈背部皮下并在四周后形成瘤体结节,其中PC3和LNCa P细胞株瘤体直径分别约15.7mm±0.6mm和14.6mm±0.7mm,四周后载瘤裸鼠体重约17.6g±1.2g(未种植的裸鼠体重约为22.5g±1.7g,两者之间存在差异,P<0.05)。超声显示瘤体边界尚清晰,内部回声不均,CDFI可见血流信号。结论:所培养的前列腺癌细胞PC3和LNCaP株均能在体外生长并能种植于裸鼠皮下成瘤,且瘤体生长良好。超声检查下能取得较好的显像效果。第二部分普通脂质纳米微泡和载STEAP-1靶向纳米脂质微泡的制备目的:制备空白脂质纳米微泡及载STEAP-1抗体靶向纳米微泡,荧光显微镜下观察与FITC标记的二抗结合的靶向纳米微泡,检测靶向微泡的稳定性。方法:采用旋转蒸发法制备空白脂质纳米微泡及生物素化空白纳米微泡,向生物素化的纳米微泡中加入亲和素以此与生物素化抗体相连接制备靶向纳米微泡,显微镜下观察两种微泡的物理性质;血球计数仪计算浓度;利用马尔文激光粒径测量仪检查两种不同微泡的粒径和表面电位,并连续1天、2天、3天、5天和一周后显微镜下观察微泡,测量微泡粒径并相互比较;分别向空白纳米微泡及靶向纳米微泡中加入FITC标记的荧光二抗,荧光显微镜下观察荧光情况;通过流式细胞仪检测振荡前和振荡后靶向微泡的结合率并相互比较来反应靶向微泡的稳定性能。结果:所制备的空白纳米微泡和靶向纳米微泡光学显微镜下均略呈圆形,粒径相对均一,分布均匀;浓度分别约4×107和3.6×106;其粒径分别约422.6nm±53.4nm和587.6nm±53.5nm,两者之间有统计学差异(P<0.05),两种微泡表面电位分别约-14.8m V±1.4m V和-19.4m V±1.8m V;连续观察并在一周后测得两种微泡的粒径平均值分别约460.5nm±48.6nm和618.5nm±47.2nm,与刚制备时相比较,均无统计学意义(P值均大于0.05);向空白组纳米微泡及靶向组纳米微泡中加入FITC标记的二抗之后荧光显微镜下观察,空白组微泡视野丢失,靶向组微泡周边可见绿色荧光;流式细胞仪检查振荡前后的靶向纳米微泡结合率分别约(95.1±2.7)%和(93.5±2.1)%,振荡前后结合率相比来说,没有统计学差异(P>0.05)。结论:成功制备了普通纳米脂质微泡与靶向纳米脂质微泡,且靶向微泡粒径大于普通微泡,两组微泡的稳定性均较好,靶向纳米微泡也能够特异性的结合抗原,为下一步体外实验提供了基础。第三部分载STEAP-1靶向纳米微泡对前列腺癌细胞的体外寻靶能力研究目的:鉴定两种前列腺癌细胞的STEAP-1抗体表达情况,显微镜下观察靶向纳米微泡与前列腺癌细胞的体外结合情况,抗体饱和实验后再次观察靶向微泡与癌细胞的结合情况。方法:培养两种上述提供的前列腺癌细胞,并分别制备细胞爬片,每组癌细胞制作5份爬片,再将制作的细胞爬片经4%的多聚甲醛进行细胞固定和1%BSA封闭液封闭后加入一定量的STEAP-1抗体(稀释1000倍),再向其中滴入一定量的FITC标记的羊抗小鼠荧光二抗(稀释200倍),室温下避光反应30分钟后于荧光显微镜下观察。制作空白纳米微泡和靶向纳米微泡待用,再次制作前列腺癌细胞PC3和LNCa P株爬片,每组细胞株10份,同样经4%多聚甲醛固定及1%BSA封闭后分组,即空白纳米微泡(A)组和靶向纳米微泡(B)组,两组中分别随机分分配5份PC3爬片(A1、B1)和LNCa P株爬片(A2、B2),并向其中滴入空白纳米微泡和靶向纳米微泡,镜下观察微泡与细胞的粘附情况。分别准备3份PC3爬片和LNCa P株爬片,加入足量的STEAP-1抗体后再次加入载STEAP-1靶向纳米微泡,镜下观察所制备的靶向微泡与癌细胞结合情况。结果:加入STEAP-1抗体和FITC标记的羊抗小鼠荧光二抗反应后的爬片于荧光显微镜下观察均可见绿色荧光。空白纳米微泡组A1和A2细胞周围均未见明显微泡聚集,而对于靶向纳米微泡组,A1和A2细胞周围均可见微泡聚集。在细胞爬片中加入足量STEAP-1抗体后再加入载STEAP-1靶向纳米微泡反应后,镜下观察两组细胞周围仅仅极少的微泡与细胞相互结合。结论:前列腺癌细胞PC3株和LNCaP株均能表达STEAP-1抗原,载STEAP-1抗体靶向纳米微泡可与前列腺癌细胞PC3株和LNCa P株在体外相互结合。
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