乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)属于嗜肝DNA病毒科,感染肝细胞后可以引起急性肝炎、慢性肝炎和重型肝炎。虽然乙肝疫苗的应用使HBV感染率有所下降,但目前全世界仍有20亿人感染HBV,其中约3.5亿人是HBV慢性感染者,仍然是肝细胞肝癌(HCC)发生的主要危险因素之一,严重危害人类的健康。因此,研究HBV复制的调控机制,发现能够清除HBV感染、阻断HBV相关疾病发展的潜在靶点,将为临床诊治提供新的契机。泛素蛋白酶体途径可通过介导蛋白质的泛素化修饰,促进体内蛋白质的降解,参与调节细胞的众多生物学功能,在维持细胞和机体内环境稳定过程中发挥重要作用。在真核细胞中,泛素活化酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3共同催化泛素分子的转移反应,促进蛋白质的泛素化降解。其中,E3泛素连接酶通过特异性地识别底物蛋白,介导泛素高特异性的连接到不同的蛋白质上,在此途径中扮演着重要的角色。近年来,有研究证明泛素蛋白酶体途径参与调控HBV的复制周期。使用蛋白酶体抑制剂硼替佐米(bortezomib)注射HBV转基因小鼠能够显著降低HBV DNA的含量,同时,干扰素抑制HBV的复制依赖于蛋白酶体的活性。但也有研究发现,在HBV转基因小鼠以及注射了HBV全基因表达质粒的C57BL/6小鼠中发现使用蛋白酶体抑制剂MLN-273却能促进HBV的复制。因此蛋白酶体途径与HBV复制之间的关系还不是很清楚。CUL4B是近年在X连锁精神发育迟滞疾病中克隆、发现的一个新致病基因,其突变可以引起患者智力低下、失语、巨大舌、身材矮小等。CUL4B属于Cullin-RING基因家族的一员。人体内已经鉴定存在8个Cullin家族基因,分别为CUL1、CUL2、CUL3. CUL4A. CUL4B、CUL5、CUL7和PARC,每一个cullin蛋白都能组装成独特的E3泛素连接酶复合物,参与调控细胞周期、细胞的增生与分化、DNA复制与修复、信号转导、病毒感染等各种细胞生命过程,对维持细胞的正常生理功能具体非常重要的作用。关于CUL4B E3泛素连接酶是否参与调节HBV复制,目前尚无报道。因此,本课题对于CUL4B E3泛素连接酶在HBV感染中的作用及其分子机制进行了初步的探讨。研究目的：1.研究CUL4B对HBV复制的影响。2.探讨CUL4B调控HBV复制的分子机制,为抗病毒治疗方案提供科学依据。研究方法1. CUL4B对HBV复制的调控作用1.1临床标本和HBV转基因鼠分析CUL4B与HBV复制的相关性1.1.1临床肝组织标本中分析CUL4B与HV复制的相关性收集43例HBV阳性的肝组织标本,提取肝组织RNA, real-time PCR检测CUL4B mRNA、HBVpgRNA的水平；提取肝组织基因组DNA, real-time PCR检测HBVcccDNA;统计学分析CUL4B表达水平与HBV复制指标之间的相关性。1.1.2HBV转基因小鼠中分析CUL4B与HBV的复制的相关性6-8周龄雄性、BalB/C系HBV Tg鼠,提取肝脏组织的RNA,利用real-timePCR检测CUL4B mRNA、HBV pgRNA的水平,提取肝组织基因组DNA,real-time PCR检测HBVcccDNA;分离小鼠血清,real-time PCR检测血清中HBVDNA水平；统计学分析CUL4B表达水平与HBV复制相应指标之间的相关性。1.2CUL4B调控HBV复制的体内研究1.2.1利用CUL4B转基因鼠研究CUL4B对HBV复制的影响6-8周龄雄性CUL4B转基因鼠(CD1系,EGFP-CUL4B Tg)及相应野生型小鼠,尾静脉高压注射HBV全基因组表达质粒pcDNA3-HBV1.1, ELISA方法检测外周血HBsAg、HBeAg水平,real-timePCR方法检测两组小鼠肝组织CUL4B mRNA、HBV cccDNA、HBV pgRNA水平,统计学分析CUL4B与HBV复制指标之间的相关性。1.2.2利用Mxl-Cre CUL4BFlox/Y条件敲除鼠研究CUL4B对HBV复制的影响6-8周龄雄性条件性CUL4B基因敲除鼠(C57BL/6系,Mxl-Cre CUL4BFlox/Y)及其相应野生型小鼠,PIPC处理5天后,尾静脉高压注射HBV全基因组表达质粒pcDNA3-HBV1.1, ELISA方法检测外周血HBsAg, HBeAg水平,real-time PCR方法检测两组小鼠肝组织CUL4B mRNA. HBV cccDNA. HBV pgRNA水平,统计学分析CUL4B与HBV复制相应指标之间的相关性。1.3CUL4B调控HBV复制的体外研究HepG2.2.15细胞转染CUL4B-mi表达质粒或阴性对照Neg-mi表达质粒,BEL7402细胞、HepG2细胞、Hela细胞中分别共转HBV全基因组表达质粒和CUL4B-miRNA或阴性对照Neg-miRNA质粒,或在HepG2细胞中共转染CUL4B过表达质粒和HBV全基因组表达质粒。利用Western blot、Real-time PCR方法检测CUL4B的干扰或过表达效果以及HBVcccDNA, HBV pgRNA水平,ELISA方法检测细胞上清HBsAg、HBeAg水平,分析CUL4B过表达或沉默对HBV复制水平的影响。2.HBx在CUL4B调控HBV复制中的作用将CUL4B过表达质粒或对照质粒分别与pcDNA3-HBV1.1(HBx蛋白野生型组)或pcDNA3-HBV1.1(△HBx)(HBx蛋白表达缺失组)或pcDNA3-HBV1.1(△HBx)+pcDNA3-HBx-HA (HBx拯救组)共转染HepG2细胞中。ELISA检测HBsAg、HBeAg的分泌,real-time PCR检测CUL4B mRNA、HBV pgRNA、 HBVcccDNA水平,分析HBx在CUL4B调控HBV复制中的作用。3.HBx蛋白参与CUL4B调控HBV复制的的机制研究3.1HBx蛋白与CUL4B复合体的结合作用将HBx过表达质粒转染HEK293细胞中,转染24h后用免疫共沉淀裂解液处理细胞,收获蛋白收获蛋白利用HA抗体或CUL4B抗体进行免疫共沉淀,Westernblot检测CUL4B、DDB1、Rocl和HBx-HA的表达情况,验证HBx与CUL4B复合体的相互结合作用。3.2CUL4B复合体对HBx蛋白表达的影响将HBx表达质粒与CUL4B过表达质粒或CUL4B-miRNA或相关对照质粒共转染HEK293细胞、HepG2细胞、SMMC7721细胞,通过RT-PCR和western blot验证CUL4B对HBx表达的影响；将CUL4B拯救质粒与HBx表达质粒共转染CUL4B低表达的HEK293细胞、Hela细胞,Western blot检测HBx蛋白的表达变化,进一步验证CUL4B对HBx表达的影响。此外,将HBx表达质粒与DDB1siRNA或ROC1siRNA共转染HEK293细胞,Western blot检测HBx蛋白的表达情况,验证DDB1、ROC1对HBx表达的影响。3.3CUL4B对HBx蛋白半衰期的影响将HBx表达质粒转染CUL4B低表达或对照HEK293细胞,经蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHX)处理后,收集不同时间点的细胞蛋白,western blot检测HBx蛋白的表达变化,观察CUL4B对HBx蛋白半衰期的影响。3.4CUL4B对HBx蛋白降解的调控作用将CUL4B siRNA或阴性对照NC siRNA与HBx表达质粒共转染Hela细胞、HEK293细胞、HepG2细胞、SMMC7721细胞,并用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞,Western blot检测HBx蛋白的表达变化,明确CUL4B对HBx蛋白降解的调控作用。3.5CUL4B对HBx蛋白泛素化修饰的影响将HBx过表达质粒转染CUL4B低表达或对照HEK293细胞,蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞后,利用HA抗体进行免疫共沉淀,western blot检测泛素分子的表达,观察CUL4B对HBx蛋白泛素化修饰的影响。研究结果1.CUL4B正向调控HBV的复制1.1临床标本和HBV转基因鼠中CUL4B表达与HBV复制呈现正相关性1.1.1临床肝组织标本中CUL4B表达与HBV复制水平呈正相关Real-time PCR检测HBV阳性肝组织中CUL4B、HBV pgRNA和HBVcccDNA表达,统计学分析结果显示,CUL4B mRNA水平与HBV阳性患者肝组织中HBV pgRNA和HBV cccDNA水平均呈现正相关性。1.1.2HBV转基因鼠中CUL4B表达与HBV复制水平呈现正相关性Real-time PCR检测HBV转基因鼠肝组织中CUL4B、HBV pgRNA和HBVcccDNA表达及血清中HBV DNA水平,统计学分析结果显示,CUL4B mRNA水平与HBV转基因鼠肝组织中HBV pgRNA、HBV cccDNA水平及血清中HBVDNA水平均呈现正相关性。1.2体内实验证实CUL4B可促进HBV复制1.2.1CUL4B转基因鼠可上调HBV复制水平CUL4B转基因鼠和野生型对照小鼠经尾静脉高压注射HBV表达质粒后,Real-time PCR结果显示：CUL4B转基因鼠肝脏组织中CUL4B mRNA显著高于野生型对照组小鼠,同时肝组织中pgRNA、cccDNA表达水平亦显著升高；ELISA结果显示：CUL4B转基因小鼠血清中HBsAg、HBeAg水平明显高于野生型小鼠,提示CUL4B高表达可正向调节HBV复制。1.2.2Mxl-Cre CUL4BFlox/Y基因敲除鼠可抑制HBV复制Mxl-Cre CUL4BFlox/Y小鼠与野生型对照小鼠经PIPC处理后,尾静脉高压注射HBV表达质粒,Real-time PCR结果显示：Mxl-Cre CUL4BFlox/Y小鼠肝脏组织中CUL4B mRNA明显低于对照组,同时pgRNA、cccDNA水平显著降低；ELISA结果显示：Mxl-Cre CUL4BFlox/Y小鼠血清中HBsAg、HBeAg水平显著低于野生型小鼠,进一步提示CUL4B可在体内促进HBV复制。1.3体外实验进一步验证CUL4B对HBV复制的正向调节作用肝癌细胞系过表达CUL4B表达、转染HBV基因表达质粒后,CUL4B过表达可上调细胞中pgRNA、cccDNA水平及上清中HBsAg、HBeAg水平；与之相反,干扰肝癌细胞中CUL4B表达,可下调细胞中pgRNA、cccDNA水平及上清中HBeAg水平,进一步验证了CUL4B对HBV复制的促进作用。2.HBx蛋白参与CUL4B对HBV复制的调节作用HepG2细胞分别共转染CUL4B表达质粒与HBV全基因表达质粒、HBx缺失型HBV质粒HBV(△HBx)或经HBx质粒拯救的HBx缺失型HBV质粒后,与HBV全基因表达质粒转染组相比,HBx缺失型HBV质粒转染细胞中pgRNA、 cccDNA水平和HBsAg、HBeAg分泌水平显著降低,而HBx表达质粒可恢复HBx缺失型HBV质粒转染细胞的复制水平,进一步证实HBx在HBV复制中的重要作用。CUL4B过表达可显著上调HBV全基因转染细胞中pgRNA、cccDNA水平和HBsAg、HBeAg分泌水平,而对HBV(△HBx)转染细胞中病毒复制的影响有所减弱,HBx过表达可恢复CUL4B对HBV(△HBx)转染细胞中病毒复制的促进作用。3.CUL4B调控HBx蛋白泛素化降解过程3.1HBx可与CUL4B复合体相结合HEK293细胞过表达HBx,转染24h后用免疫共沉淀裂解液裂解细胞,收获蛋白进行免疫共沉淀试验,Western blot结果显示,HBx可以与CUL4B、DDB1、ROC1相互结合。3.2CUL4B复合体上调HBx蛋白的表达肝癌细胞、HEK293细胞和Hela细胞中,过表达或干扰CUL4B观察HBxmRNA和蛋白的表达变化。RT-PCR结果显示：过表达或干扰CUL4B对HBxmRNA水平无明显影响；western blot结果显示：过表达CUL4B能够上调HBx蛋白的表达,相反地,干扰CUL4B能够抑制HBx蛋白的表达,且CUL4B拯救质粒能够剂量依赖性地恢复CUL4B低表达细胞中HBx蛋白的表达。以上结果提示,CUL4B能够上调HBx蛋白的表达。HEK293细胞分别转染DDB1siRNA、 ROC1siRNA, Western blot结果显示：干扰DDB1或ROC1的表达均可以抑制HBx蛋白的表达,以上结果提示：CUL4B复合体可上调HBx蛋白的表达。3.3CUL4B可延长HBx蛋白的半衰期为进一步研究CUL4B影响HBx蛋白表达的分子机制,课题检测了CUL4B对HBx蛋白半衰期的影响。经蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHX)处理后不同时间点, CUL4B低表达的稳筛细胞系HEK293中HBx蛋白的表达显著低于对照组细胞。且CUL4B低表达细胞中HBx蛋白的降解速率显著高于对照组细胞。提示：CUL4B通过延长HBx半衰期进而上调HBx蛋白的表达。3.4CUL4B抑制HBx蛋白的蛋白酶体降解途径已有研究证实,HBx蛋白主要通过泛素-蛋白酶体途径降解。为研究蛋白酶体降解途径在CUL4B调控HBx蛋白表达中的作用,课题利用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞,western blot结果显示：干扰CUL4B表达可显著降低HBx的表达,而MG132可逆转CUL4B低表达对HBx蛋白表达的抑制作用。提示CUL4B可能通过影响泛素-蛋白酶体途径调控HBx蛋白的表达。3.5CUL4B抑制HBx蛋白泛素化修饰为进一步研究泛素-蛋白酶体降解途径在CUL4B调控HBx蛋白表达中的作用,课题检测了CUL4B对HBx泛素化修饰的影响。利用HA抗体进行免疫共沉淀,western blot检测泛素水平,结果显示CUL4B低表达细胞中HBx-HA的泛素化水平显著高于对照组细胞,提示CUL4B可通过抑制HBx蛋白的泛素化修饰,进而阻断HBx蛋白的蛋白酶体降解途径。研究结论与研究意义1.首次发现CUL4B E3泛素连接酶可促进HBV复制,为阐明CUL4B在人类疾病,尤其是病毒感染相关疾病中的作用提供了重要依据。2.证实HBx蛋白在CUL4B调控HBV复制中发挥重要作用,揭示了HBx蛋白参与HBV复制的新分子机制。3.首次证实CUL4B复合体可与HBx蛋白结合,进而抑制HBx蛋白的泛素-蛋白酶体降解过程,上调HBx蛋白的表达,为阐释泛素-蛋白酶体途径调控HBV复制的分子机制提供了新的证据。