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[研究背景及目的]脊柱结核(STB)是发病率最高的肺外结核,致残率较高。对于结核分枝杆菌在结核中的病理过程尚未完全清楚。近期研究表明:结核分枝杆菌感染巨噬细胞的过程中,可通过某种途径控制了某些miRNA的表达,对其细胞活性和功能进行调控。最终实现在巨噬细胞内寄生和长期存活,在一定条件下复制增多而引发结核病。花生四烯酸代谢途径CYP450代谢途径是近期发现的一条新途径,在人体中的生物化学和病理学意义还未认识和阐明。人体血液中单核细胞和巨噬细胞内表达的CYP450同工酶主要为CYP450 1b1[15]。相关研究表明:花生四烯酸细胞色素P450代谢途径产生的环氧化二十碳三稀甘油酸(EETs)可通过多种途径抑制细胞凋亡。结合杆菌抑制巨噬细胞凋亡可能与该途径有关。在我们的前期基因芯片研究发现miR-27b的表达在脊柱结核患者中有显著变化,进一步的实验结果显示:miR-27b在结核杆菌诱导巨噬细胞凋亡中同样有显著变化,表明miR-27b在结核杆菌感染过程中发挥重要作用,其可通过调节巨噬细胞凋亡增多从而影响结核病的发病过程,但其具体发病机制尚不清楚。经过生物信息学分析发现CYP450 1b1可能是miR-27b的一个靶基因。故我们推测结核杆菌可能通过调控miR-27b及其靶基因CYP450的表达,调节花生四烯酸途径使EETs减少而抑制单个核细胞的凋亡,从而达到影响脊柱结核的病理过程。本研究对这一假设进一步验证。[材料和方法]1、miR-27b及预测靶基因CYP450 lbl在脊柱结核临床样本中的表达:根据患者临床表现,影像学资料和相关的实验室检查,结合穿刺活检或手术取材病理组织学检查结果设立脊柱结核病例;病例组(n=30)和对照组(n=12),在抗痨治疗实施前抽取外周血标本5mL,加入Ficoll试剂后进行梯度离心,获取单个核细胞。对照组人群来源于我院健康体检中心健康自愿者,同法获得外周血单个核细胞 peripheral blood mononuclear cell(PBMC)。再提取总 RNA 及 microRNA 并进行反转录后对样本中mRNACYP450 lbl及miR-27b进行RT-PCR检测,对其△△CT值进行统计学分析(p<0.05有统计学意义),并通过分析miR-27b和CYP4501bl对脊柱结核检测的特异性和敏感性,建立受试者操作特征曲线(ROC曲线),利用曲线下面积指标(AUC)评价其对脊柱结核的诊断效率。2、靶基因关系的验证:采用荧光素酶报告基因验证miR-27b与细胞色素P450lb1(CYP 4501bl)的基因-靶基因关系。3、miR-27b对花生四烯酸CYP450代谢途径对巨噬细胞凋亡的影响验证:a、miR-27bmimics转染:Thp-1诱导分化为巨噬细胞。使用Lipofectamine2000法将目的基因miR-27b mimics进行转染,根据转染量分设为空白对照组,2.5ul,5ul,1 Oul共4组。并将FAM control mimics进行转染,设立阴性对照组,同样根据转染浓量分为空白对照组。b、流式细胞仪检测miR-27bmimics转染巨噬细胞后的凋亡水平。c、miR-27b mimics转染后CYPlbl基因表达水平:取转染了 miR-27b mimics不同浓度的巨噬细取总RNA,变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量后进行反转录。转录后进行RT-PCR反,计算不同转染浓度巨噬细胞中CYP450lb1基因的AACT后进行统计学分析(p<0.05有统计学意义)。d、Western blot检测CYP450 lbl表达水平。e、ELSIA检测EET表达量。[结果]1、临床样本检测:实验组CYP450 lbl基因RT-PCR检测△ △ CT值与健康对照组相比表达升高(1.76±0.69/1.18±0.27),miR-27b基因RT-PCR检测△△(CT值与健康对照组相比表达升高表达降低(0.92±0.22/1.18±0.32),两者都呈现差异性表达(p<0.05)。miR-27b与CYP4501bl检测脊柱结核患者的敏感性分别为0.67%及0.585,特异性分别为83%及91%,AUC分别为0.786及0.814。2、荧光素酶报告基因显示:当表达miR-27b的质粒同表达CYP4501bl基因3’ UTR的野生型质粒共同转染巨噬细胞时,荧光素酶的表达值降低,同对照组相比降低(6.469 ±0.886/8.901±0.935),具有显著性差异(p<0.05),而当将11个碱基序列,即假定的结合位点突变之后,由于过表达的miR-27b不能再特异结合到荧光素酶报告基因载体上,即无法调控荧光素酶报苦基因的表达,所以荧光素酶的表达含量同对照组相比(12.305±1.518/10.807±2.287)无显著差异(p>0.05)。以上结果表明,miR-27b可以下调巨噬细胞中CYP4501b1基因的表达,CYP4501b1基因是miR-27b的靶基因。3、miR-27b功能验证:转染miR-27bmimics基因空对照组,2.5ul组,5ul组,10ul组的巨噬细胞凋亡率分别为0%,9.4%,6.8%,8.4%,结果显示miR-27b表达量增加可促进巨噬细胞凋亡。转染miR-27b mimics基因空对照,2.5ul,5ul,10ul浓度的巨噬细胞的CYP450 1b1基因PCR检测△△CT值值分别为1,0.36,0.15,0.02,结果显示随着miR-27b转录浓度升高,CYP450 1b1基因表达量减少。Western blot检测转染后巨噬细胞CYP4501b1达水平降低。ElISA检测结果显示空对照组,2.5ul组,5ul组,10ul组的EEt-14、15 表达量分别为 20.748pg/ml,11.106pg/ml,13.336pg/ml,9.727pg/ml。随着miR-27b转录浓度的升高EEt-14、15表达量下降。[结论]1、脊柱结核病人外周血单个核细胞中miR-27b表达量降低,CYP4501b1.基因表达量增高与健康人群对照组间存在明显的差异。miR-27b及CYP4501b1可能成为脊柱结核早期诊断分子标记物之一。2、miR-27b与CYP4501b1基因间存在基因-靶基因关系。3、miR-27b表达降低,巨噬细胞中CYP4501b1基因表达量升高,其下游产物EETs表达量升高,凋亡率降低。综上所述,miR-27b的靶基因为CYP4501b1,在结核分枝杆菌(MTB)病程中miR-27b的表达降低,其作用是增加靶基因CYP4501b1的表达,通过花生四烯酸途径降低EEts的表达使PBMC的凋亡率减少,从而影响结核分枝杆菌的病理过程。