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黄酮类化合物是一类广泛存在于自然界的植物次级代谢产物,具有免疫调节、抗菌、抗病毒、抗氧化和抗肿瘤等生物活性。许多黄酮类化合物因自身带有糖基化修饰而起到调节理化性质和生物活性等作用。目前,黄酮类化合物的体外特异性糖基化修饰成为研究热点,主要包括化学法和酶法合成两种方式。化学法合成必须依赖繁琐的选择性保护和去保护作用,相比之下,酶法合成显示出独特的优越性,快速、高效且具有立体选择性和区域选择性。体外酶法合成主要包括糖苷酶法和糖基转移酶法。糖苷酶（Glycosidase,EC 3.2.1.x）是一类能够催化糖苷键断裂的酶。α-L-鼠李糖苷酶（α-L-rhamnosidase,EC3.2.1.40）是一种重要的糖苷水解酶,能够水解鼠李糖基寡糖非还原端的α-L-鼠李糖苷键,也可以水解α-L-鼠李糖基化合物如橙皮苷、柚皮苷等,同时一些α-L-鼠李糖苷酶还具有鼠李糖苷合成能力,能够利用鼠李糖为供体通过反向水解反应合成鼠李糖苷,在食药领域应用前景广阔。糖基转移酶（Glycosyltransferase,EC2.4.x.y）通常以核苷酸活化的单糖高效特异催化糖苷键的形成。因此,在黄酮类化合物的合成、修饰中具有广泛的应用。鼠李糖基转移酶（Rhamnosyltransferase,RhaTs,EC2.4.1.159）是一类需要核苷酸化的鼠李糖作为供体催化合成鼠李糖基寡糖和鼠李糖基化合物的酶,存在于细菌、真菌和植物中。植物来源的RhaTs需要以UDP-β-L-鼠李糖（UDP-Rha）为供体。由于UDP-Rha供体结构复杂,具有特殊的β-Rha糖苷键,目前还没有商业化纯品,已经成为鼠李糖基寡糖和鼠李糖基化合物合成的瓶颈。柑橘加工副产物中含有大量的橙皮苷（Hesperidin）,是橙皮苷提取的重要来源。新橙皮苷（Neohesperidin）和橙皮苷是同分异构体,且能够进一步氢化生成新橙皮苷二氢查耳酮（Neohesperidindihydrochalcone,NHDC）,NHDC 比蔗糖甜 1000～1500 多倍且热量低,不会影响人体的血糖和血脂水平,是一种具有巨大应用潜力的食品添加剂。生物酶法由橙皮苷转化为新橙皮苷需要经过两个步骤:（1）使用α-L-鼠李糖苷酶特异性水解α-1,6-鼠李糖苷键生成橙皮素-7-O-葡萄糖苷（Hesperetin-7-O-glucoside,H7G）;（2）以H7G为受体,UDP-Rha为供体,在柚子来源的α-1,2-鼠李糖基转移酶（Cm1,2RhaT）的催化下特异性地在H7G的葡萄糖分子上合成α-1,2-鼠李糖苷键生成新橙皮苷。虽然已有报道显示,橙皮苷可以通过酶法水解和酸水解去除鼠李糖生成橙皮素-7-O-葡萄糖苷,但是目前已有的方法均不能选择性去除鼠李糖基,会同时发生鼠李糖基和葡萄糖基的全部去除,不适合规模化应用。目前对于柚子来源的鼠李糖基转移酶（Cm1,2RhaT）的研究报道都集中在体外以H7G为受体底物转鼠李糖基利用烟草细胞粗酶液生成产量较低的新橙皮苷（产量为0.05～0.08mM）,规模化制备新橙皮苷还面临着巨大的挑战。因此建立橙皮苷的鼠李糖基的选择性酶法水解高效制备H7G,进一步以H7G为底物建立新橙皮苷的一锅生物酶法合成体系,实现绿色高效的以橙皮苷为原料制备新橙皮苷,具有重要的科学意义和应用价值。本论文首先建立了以橙皮苷为底物酶法高效制备H7G的方法。利用PCR扩增技术获得了研究室已经发表的真菌链格孢菌（Alternariasp.L1）和实验室正在研究的细菌约氏黄杆菌（Flavobacterium johnsoniae UW101）的α-L-鼠李糖苷酶基因RhaL1（GenBank accession No.AFA41506,2.0 kb）和 FjGH78Rha（GenBank accession No.ABQ07113.1,2.2 kb）,构建了重组质粒 pET15b/RhaL1 和 pET28a/FjGH78Rha并转化至E.coli DH5α中进行克隆和目的基因的菌液PCR验证,将测序正确的阳性重组子和本实验室已经构建好的其余6种α-L-鼠李糖苷酶重组质粒转化至E.coli BL21（DE3）中进行表达,将这8种α-L-鼠李糖苷酶的粗酶液进行橙皮苷水解活性的初步TLC筛选,发现真菌链格孢菌（Alternaria sp.L1）和细菌约氏黄杆菌（Fjohnsoniae）来源的两种α-L-鼠李糖苷酶的粗酶液对橙皮苷的水解活性较高。经镍亲和层析一步纯化后的两种重组酶蛋白,分子量约为 75 kDa（RhaL1）和 83 kDa（FjGH78Rha）,分别与预测分子量 73.5 kDa（RhaL1）和83.6kDa（FjGH78Rha）一致,橙皮苷水解活性的进一步TLC筛选结果显示,约氏黄杆菌来源的FjGH78Rha对于橙皮苷的水解活性较高。通过对该酶的酶学性质表征,发现其最适pH为7,在pH 6.0～10.0稳定;最适温度为40℃,在20～50 ℃保温时稳定;Li+、Cu2+、EDTA几乎使酶完全失活,Ag+和Co2+分别使酶失活91%和42%,K+、Na+、NH4+、Zn2+、Fe3+对酶活有促进作用。5 mM橙皮苷为底物在8 U重组FjGH78Rha的催化下,37℃、pH 7、反应24 h生成H7G的转化率高于95%,H7G的产量高于4.7mM,反应液的HPLC分析显示在保留时间13 min的峰为产物H7G,保留时间为12.5 min的峰为底物橙皮苷,将乙酸乙酯初步提纯的H7G采用硅胶柱进一步分离纯化,纯化后的产物的质谱检测结果发现有[M+H]+为465.1427的信号峰,符合H7G的理论分子量为464.13。硅胶柱分离出的H7G为后续新橙皮苷的合成提供了受体底物。本论文同时还建立了酶法合成UDP-Rha的方法。拟南芥（Arabidopsisthaliana）的三功能酶AtRHM2融合了 UDP-D-葡萄糖-4,6-脱水酶（EC 4.2.1.76）、UDP-4-酮-6-脱氧-D-葡萄糖-3,5-差向异构酶（EC 1.1.1.x）和UDP-4-酮-L-鼠李糖-4-酮-还原酶（EC5.1.3.x）三个功能,能够以UDP-Glc为底物三步催化生成UDP-Rha。AtRHM2-N是AtRHM2的N端结构域,能够以UDP-Glc为底物发挥脱水活性一步催化生成UDP-4-酮-6-脱氧-D-葡萄糖（UDP-4K6DG）。拟南芥的双功能酶AtUER1融合了 AtRHM2的异构和还原功能,能够以UDP-4K6DG为底物二步催化生成UDP-Rha。（1）PCR扩增了拟南芥的三功能酶AtRHM2基因（GenBank accession No.NP564633.2,2.0kb）,构建了 pPIC9K/AtRHM2重组质粒并转化至毕赤酵母菌株GS115分泌表达,以硫酸铵沉淀法从培养液上清样品中浓缩并部分纯化获得AtRHM2重组蛋白,其分子量约为75 kDa,与预测分子量75.2 kDa相一致,但未检测到其催化活性。同时将AtRHM2与谷胱甘肽转移酶（Glutathione S-transferase）基因融合表达,构建了pGEX4T-1/AtRHM2重组质粒,转化至E.coli DH5α中进行克隆和目的基因的菌液PCR验证,将测序正确的阳性重组子在E.coli Rosetta-gami B（DE3）中表达,经GST琼脂糖凝胶亲和层析一步纯化获得了重组酶AtRHM2蛋白,融合GST的蛋白分子量约为101 kDa,与预测分子量101.2 kDa（GST分子量26 kDa+AtRHM2蛋白75.2 kDa）相一致。酶活性检测发现重组AtRHM2的反应产物中,质谱分析只检测到产物的离子峰（m/z）为[M-H]-547.0378,与 UDP-4K6DG 或UDP-4-酮-L-鼠李糖（UDP-4KR）的理论分子量548.04相对应,没有检测到UDP-Rha。由于UDP-4K6DG和UDP-4KR理论分子量相同,说明重组AtRHM2表现出了脱水酶活性,也有可能还表现出了异构酶活性,但未表现出理论上的三功能酶活性。（2）PCR扩增了AtRHM2-N基因（AtRHM2的N末端,1～370个氨基酸,1.1 kb）,构建了 pGEX4T-1/AtRHM2-N重组质粒,转化至E.coli DH5α中进行克隆和目的基因的菌液PCR验证,将测序正确的阳性重组子在E.coli Rosetta-gami B（DE3）中表达,经GST琼脂糖凝胶亲和层析一步纯化获得了重组酶AtRHM2-N蛋白,融合GST的蛋白分子量约为68 kDa,与预测分子量67.7 kDa（GST分子量26 kDa+AtRHM2-N蛋白41.7 kDa）相一致,酶活性检测发现重组AtRHM2-N的反应产物中,质谱分析只检测到产物的离子峰（m/z）为[M-H]-547.0334,与 UDP-4K6DG 或 UDP-4KR 理论分子量 548.04 相对应,说明重组AtRHM2-N表现出了脱水酶活性。由于AtRHM2的蛋白表达量比AtRHM2-N高,后续反应都采用AtRHM2和AtUER1酶联反应进行UDP-Rha的合成。（3）通过PCR技术扩增获得了拟南芥的双功能酶AtUER1基因（GenBankaccession No.NP564806.1）,构建了 pGEX4T-1/AtUER1 重组质粒,转化至E.coli DH5α中进行克隆和目的基因的菌液PCR验证,将测序正确的阳性重组子在E.coli Rosetta-gami B（DE3）中表达,经镍亲和层析一步纯化获得了重组AtUER1,融合GST蛋白的分子量约为60 kDa,与预测分子量59.6kDa（GST分子量26kDa+AtUER1蛋白33.6kDa）相一致。检测到重组AtUER1能以UDP-4K6DG为底物催化生成UDP-Rha,反应液的ESI-MS显示有一个质荷比为549.0325的[M-H]-离子峰,与UDP-Rha的理论分子量550.06相一致,说明其表现出了异构和还原的双功能酶活。（4）建立了以UDP-Glc为底物、AtRHM2-AtUER1双酶联合高效合成UDP-Rha的反应体系。反应液的HPLC分析显示产物UDP-Rha的保留时间为18 min,保留时间21 min的液相峰为底物UDP-Glc。通过对反应条件的优化发现,最佳UDP-Glc浓度为4 mM、NAD+浓度为 2 mM、NADPH 浓度为 3 mM,最佳酶浓度 AtRHM2 0.005 mM、AtUER1 0.01 mM,最佳温度为30 ℃,最佳pH为7,反应5 h,实现了 UDP-Rha的最高产量1.4mM,比优化前提高了 2倍,为后续新橙皮苷的合成提供了供体底物。本论文进一步建立了一锅酶法合成新橙皮苷的体系。首先根据酵母表达系统进行了密码子优化合成了柚子（Citrus maxima）来源的1,2-鼠李糖基转移酶基因Cm1,2RhaT（GenBankaccession No.Q8GVE3.2,1.4kb）,构建重组质粒pGEX4T-1/Cm1,2RhaT,转化至E.coli DH5α中进行克隆和目的基因的菌液PCR验证,将测序正确的阳性重组子转化至E.coli C41（DE3）表达,经镍亲和层析一步纯化后获得可溶且有活性的重组Cm1,2RhaT,融合GST的分子量约为77kDa,与预测分子量77.2kDa（GST分子量26 kDa+Cm1,2RhaT蛋白51.2 kDa）相一致。反应液的ESI-MS检测显示有一个质荷比为610.19的[M+Na]+离子峰,与新橙皮苷的理论分子量633.18相对应,说明一锅酶法合成了新橙皮苷,反应液的HPLC分析显示保留时间为3 min的是新橙皮苷,保留时间为3.4 min的液相峰是底物橙皮素-7-O-葡萄糖苷。在50mMTris-HCl缓冲液中,以1 mMH7G为受体底物,4mM UDP-Glc为供体底物,再加入2mM NAD+、3mMNADPH、0.005 mMAtRHM2、0.01 mMAtUER1 和 0.006 mM Cm1,2RhaT,一锅酶法合成了新橙皮苷,并对新橙皮苷的一锅酶法合成条件进行了优化,得出最佳温度为30 ℃,最佳pH为7.5,反应10 h新橙皮苷的转化率为90%,产量为0.9 mM。本论文通过对8种α-L-鼠李糖苷酶的筛选,首次实现了酶法特异水解橙皮苷中的α-1,6-鼠李糖苷键高效制备橙皮素-7-O-葡萄糖苷;同时构建了 AtRHM2-AtUER1双酶联合高效合成UDP-Rha的反应体系,进一步偶联首次在大肠杆菌中成功表达的柚子来源的1,2-鼠李糖基转移酶Cm1,2RhaT,成功构建了一锅酶法反应体系,产量为0.9mM,首次实现了体外橙皮素-7-O-葡萄糖苷的α-1,2-鼠李糖基化定位高效合成,对于以橙皮苷为底物转化新橙皮苷的规模化绿色生产具有重要的理论指导和实践意义。