【背景与目的】Holt-Oram综合征（Holt-Oram Syndrome,HOS）,又名心手综合征（HeartHand Syndrome）,是一种以上肢发育异常和先天性心脏病为主要临床特点的常染色体显性遗传病。TBX5基因突变是导致HOS发生的最重要分子致病机制。与HOS相关的突变分布在TBX5基因内,且大多数都集中在T-box DNA结合域。最近的报道称,TBX5在启动子区、3′非翻译区和增强子区等非编码区发生的突变与HOS相关。本研究在来自中国南方地区的一个家系中发现,3名患者表现为不同程度的先天性心脏病和手部畸形,临床确诊为Holt-Oram综合征。本研究旨在通过对该家系成员进行基因检测,鉴定该家系的TBX5致病突变,并应用分子生物学技术研究该基因突变位点导致HOS的可能致病机理。预期结果将丰富TBX5基因突变数据库的内容;结合胚胎植入前遗传学诊断和辅助生殖技术,将为阻断突变基因遗传、生育健康婴儿作出贡献。【材料与方法】本研究分别对3名HOS患病成员进行心脏超声和手部X光片检查。取得知情同意书后,采集该家系中3名患者及表型正常成员的外周静脉血,提取其基因组DNA。对先证者进行全外显子组测序,测序数据通过生物信息学分析,筛查出候选致病突变。然后对上述成员进行Sanger测序和突变位点高精度高深度测序,验证突变位点在该家系成员中的突变频率,确定可能导致HOS发生的TBX5疑似致病突变。应用minigene技术,研究疑似致病突变对TBX5信使RNA（messager RNA;mRNA）剪接的影响;应用逆转录实时荧光定量PCR（Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,q RT-PCR）和Western Blot方法,研究疑似致病突变对TBX5基因mRNA和蛋白表达的影响;应用免疫荧光实验,分析疑似致病突变对TBX5蛋白细胞核内定位的影响;应用细胞增殖活性实验,分析疑似致病突变对细胞活力的影响。【结果】心脏超声检查显示,先证者及其胞弟（III-1和III-2）表现出严重的心脏结构缺陷,包括房间隔缺损（继发孔型）、肌部室间隔缺损、三尖瓣反流和肺动脉高压;手部X光片显示,两患者拇指发育不全,I-II指并指,第一掌骨发育不全和拇指弯曲受限。而先证者母亲（II-2）除了拇指弯曲受限外,心脏和手部均无明显异常。全外显子组测序发现,先证者III-1存在一个未经报道的TBX5 c.755+1 G>A突变;经Sanger测序验证,确认3个患病家族成员均具有该突变,其他表型正常成员均不存在该突变。突变位点高精度高深度测序发现,家系成员II-2,III-1和III-2血液样本中TBX5 c.755+1 G>A突变频率分别为38.08%,50.01%和48.28%。Minigene技术结果显示,TBX5 c.755+1 G>A突变影响TBX5 7号外显子的正常剪接,导致部分7号内含子56 bp滞留,并产生了异常的TBX5 mRNA转录本。进一步生物信息学分析发现,TBX5 c.755+1 G>A突变造成蛋白读码框改变,在Exon7后侧产生提前终止密码子,氨基酸改变为p.S252Rfs2,导致TBX蛋白从第252位氨基酸提前终止,产生了TBX5截短蛋白,破坏核小体重塑与去乙酰酶复合体相互作用结构域[Nucleosome remodeling and deacetylase（Nu RD）complex interaction domain;NID]。q RT-PCR结果显示,TBX5 c.755+1 G>A突变使异常TBX5 mRNA的转录上调;Western Blot结果显示,相比于野生型的TBX5蛋白,突变型TBX5翻译出截短型TBX5蛋白,其分子量更小,且表达量显著升高。免疫荧光实验显示,野生型TBX5蛋白定位于细胞核内,而突变型TBX5蛋白定位于细胞核与细胞质之中,提示突变型TBX5蛋白核内定位能力降低。细胞增殖活性实验显示,在培养24 h和48 h后,转染突变型TBX5重组质粒的细胞活性比转染空质粒和野生型TBX5重组质粒的细胞活性减少10%左右。【结论】TBX5 c.755+1 G>A突变为该HOS家系的新发致病突变。该突变可能影响TBX5基因7号外显子的正常剪接,导致部分7号内含子56 bp滞留,并产生了异常的TBX5转录本。该突变在体外培养细胞中促进了TBX5异常剪接的mRNA的转录和截短型TBX5蛋白的表达,降低截短型TBX5蛋白的核内定位能力并且抑制了体外培养细胞的增殖活性。