柑橘是中国南方种植面积最大的果树,在世界范围内具有很高的经济价值。通过体细胞胚胎发生获得再生植株,是柑橘种质资源保存的重要方法之一,然而柑橘愈伤组织的胚性随着保存时间的延长而减弱,这一定程度上影响了柑橘优质种质资源的保存与细胞工程育种的开展。模式植物胚胎发育研究证实,细胞骨架的功能异常、细胞程序性凋亡的非正常启动都可引起胚胎发育的延缓或者导致不育。然而这些在柑橘中尚未有所研究,并且它们如何调控胚胎发育的具体机制尚不清楚。本研究以柑橘胚性愈伤组织为材料,一方面通过建立一套稳定表达荧光蛋白标签的愈伤系,进而研究体胚发生时期亚细胞器的变化;另一方面拟借助这套愈伤细胞体系和相关试剂研究细胞骨架和自噬对体胚发生的影响。从细胞与亚细胞层面阐明胚胎发生的调控机制,为柑橘种质资源遗传改良,细胞工程育种提供新的思路与方法。主要结果如下:1.稳定表达荧光蛋白标签的柑橘愈伤组织体系的建立。转化材料为具有生胚能力的‘伏令夏’橙愈伤和生胚能力弱的‘国庆一号’温州蜜柑愈伤组织,现已获得17种稳定表达不同细胞器定位荧光蛋白的愈伤组织稳定遗传转化材料,包括微丝、微管、细胞核、过氧化酶体、内质网、高尔基体、线粒体（刘丹）、囊泡（管亚洁）和自噬体等。目前初步观察到内质网、过氧化酶体在诱导生胚时的形态变化。2.利用qPCR和试剂处理研究自噬在柑橘体胚发生过程中的作用。此研究采用强胚性愈伤组织‘默科特’橘橙,在诱导‘默科特’橘橙体胚发生过程中添加自噬调节剂,所采用药剂浓度对材料正常生长无明显影响。结果发现抑制自噬降低了柑橘体胚发生的数量,而促进自噬则刚好相反,说明自噬参与并正调控柑橘愈伤组织生胚。随后我们进一步研究了自噬调控柑橘体胚发生的途径,发现在体胚发生早期抑制自噬使淀粉含量改变,暗示了自噬可能通过影响淀粉降解来影响柑橘体胚发生;3.利用稳定转化微丝荧光蛋白的愈伤组织（Lifeact-GFP-S）和微丝抑制剂探究柑橘体胚发生中细胞骨架的变化。使用LatB处理柑橘Lifeact-GFP-S愈伤组织,观察到微丝解聚。同样用LatB处理‘默科特’橘橙愈伤组织,与对照相比,500 nM LatB处理下体胚抑制率可达到70%,后续研究会继续对体胚发生过程中微丝的动态变化和调控机制进行深入探索;以上是本文的主要结论,由于目前柑橘体胚发生过程的各个阶段难以捕捉,所以我们还挑选了一些体细胞胚发育期间特异表达的基因如:LEA、LTP、LIL、FSU4,并构建自身启动子驱动表达GFP荧光标签的载体（目前实验还在进行中）,后续转入胚性愈伤组织中,挑选合适的单系作为柑橘体胚发生时期的标记,为后续的观察提供便利。