第一部分进一步降低肝移植术后胆道并发症的实验研究　　 第一章SD大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及标记　　 目的：　　 探讨SD大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定及标记。　　 方法：　　 通过密度梯度离心法和贴壁法分离、培养SD大鼠骨髓间充质干细胞。用流式细胞仪通过细胞的表面抗原对细胞进行鉴定，并采用Brdu进行标记。　　 结论：　　 采用密度梯度离心法和贴壁法分离SD大鼠骨髓间充质干细胞简单易行，细胞纯度较高，经流式细胞仪鉴定，确定为骨髓间充质干细胞。采用Brdu标记骨髓间充质干细胞，简单、可行，便于进一步深入研究。　　 第二章携带VEGF165的腺病毒转染骨髓间充质干细胞　　 目的：　　 用携带VEGF165基因的腺病毒转染MSC(mesenchymal stem cells)，并检测目的基因VEGF165的表达情况，为下一步的深入研究奠定基础。　　 方法：　　 腺病毒感染骨髓间充质干细胞，进行基因转染实验。先用携带GFP的腺病毒感染细胞，转染48小时后，通过荧光显微镜观察细胞，并计算转染效率，确定出最佳的感染倍数。根据最佳感染倍数，进行下一步实验，MSC被随机分为两组：实验组转染携带VEGF165基因的腺病毒载体，对照组转染空的病毒载体。通过ELISA、RT-PCR和Western blot法检测VEGF165的表达情况，MTT法绘制转染后的MSC的生长曲线。　　 结论：　　 携带VEGF165腺病毒载体，能成功感染了MSC，当MOI值在100时，感染效率接近90％，且对细胞的影响较小。感染后的MSC能够表达目的蛋白VEGF，转染组的细胞较对照组生长较快。　　 第三章无心跳大鼠供肝胆道热缺血再灌注损伤的安全时限　　 目的：　　 探讨非肝素化的无心跳大鼠供肝不同的热缺血时间与胆道缺血再灌注损伤之间的关系。　　 方法：　　 采用改良的重建肝动脉的大鼠肝移植模型，供体采用无心跳，无肝素化的模型，按供肝的热缺血时间的不同分别为0分钟(WI0组)，10分钟(WI10组)，15分钟(WI15组)三组，每组36对大鼠。比较大鼠肝移植术后的生存率，胆道并发症发生率，肝功能恢复情况以及病理改变情况。　　 结论：　　 非肝素化无心跳的大鼠供肝热缺血时间超过15分钟时，移植术后胆道损伤明显，可导致不可逆改变。　　 第四章携带VEGF165基因的骨髓间充质干细胞对无心跳大鼠供肝胆道热缺血再灌注损伤修复的研究　　 目的：　　 观察经肝动脉输注转染VEGF165的MSC和单纯的MSC，对大鼠无心跳供肝胆道热缺血再灌注损伤的修复及血管生成情况，并比较联合治疗组与单独细胞移植治疗组之间的疗效差异。　　 方法：　　 采用无肝素化、无心跳热缺血供体模型和重建肝动脉的大鼠肝移植模型，供肝的热缺血时间控制在15分钟，随后将大鼠随机分为4组(每组24对)，行肝移植手术，A组(联合治疗组)在术中由肝动脉输注经肝动脉注入转染VEGF165的骨髓间充质细胞悬液0.5ml(细胞数为3×106个/ml)，B组(细胞治疗组)进行等量的MSC移植，C组(对照组)输入PBS0.5ml。另取6只为假手术组(D组)。比较大鼠肝移植术后的生存率、肝功能恢复情况、体重、胆道并发症发生率。1周时观察MSC在肝脏的分布情况，2周时用RT-PCR及Western blot检测VEGF在体内的表达情况，2周时检测胆管的增生情况，4周时用八因子抗体行免疫组化检测微血管密度，同时检测胆管数目的多少，并行MASSON染色。　　 结论：　　 经肝动脉输注骨髓间充质干细胞及转染VEGF165的骨髓间充质干细胞，能够促进肝功能恢复，减少胆道并发症，降低死亡率，通过促进血管生成及微循环得到明显的改善，有利于胆道热缺血再灌注损伤的修复，但联合组的疗效要好于单纯细胞治疗组，考虑可能与VEGF与骨髓间充质干细胞之间的协同作用有关。　　 第二部分进一步降低肝移植术后胆道并发症的临床研究　　 第一章改良胆道重建技术在肝移植手术中的应用　　 目的：　　 探讨改良胆道重建技术在肝移植手术中应用的可行性、优势。　　 方法：　　 回顾分析本院两年间完成的131例肝移植患者的临床资料。根据胆道重建方式的不同将其分为两组：A组(n=76)为接受传统胆道重建术的患者，B组(n=55)为接受改良胆道重建技术的患者。改良胆道重建最主要的特点是利用供肝获取时的胆囊灌注管或胆道重建时的胆道支架管，来改善胆道重建的条件，便于吻合且方便试漏。所有手术为同一组术者实施，且手术技术熟练。两组患者在性别，年龄，手术指征及肝功能评分等方面均相似，具有可比性。比较两组患者的胆道吻合时间，与吻合口相关的胆道并发症等情况。　　 结论：　　 利用胆囊灌注管或胆道支架管并结合精细的显微外科技术来改善胆道重建的方法是一种较理想的胆道重建方式，简便易行，术后胆道并发症少。　　 第二章肝移植术中复杂胆道重建的处理　　 目的：　　 探讨肝移植中复杂胆道重建的方法及体会，提高胆道重建的技术。　　 方法：　　 对2007年到2009年的资料完整的9例复杂性胆道重建病例的临床资料进行分析。9例患者中有手术史的患者有5例(55.6％)，其中胆道手术史的3例(33.33％)；活体肝移植2例(22.22％)；胆管癌1例(11.1％)；胰头癌1例(11.1％)。评价胆道重建的时间，胆道重建的方式，术中处理，术后并发症等资料。　　 结论：　　 对于肝移植中复杂的胆道重建要做好充分的准备，娴熟的显微外科技术及适当的重建方式非常重要，留置胆道支架管是安全、可行的。　　 第三章肝移植术后胆道并发症的诊治体会　　 目的：　　 探讨肝移植术后胆道并发症的诊治体会。　　 方法：　　 对2007年到2009年的资料完整的23例肝移植术后不同类型的胆道并发症的患者临床资料进行分析。评价胆道并发症的类型，处理方式及术后恢复情况等资料，并结合文献复习。　　 结论：　　 肝移植术后胆道并发症危害大，关键在于预防；一旦出现胆道并发症，要根据情况及时处理，预后较好。