论文部分内容阅读
奶牛乳腺纤维化是奶牛养殖业中发病率和感染率较高的一种疾病,不同的病原菌引起的乳腺炎可导致不同程度的乳腺纤维化,而严重的纤维化可导致乳腺的硬化甚至奶牛淘汰,这大大降低了奶牛业的经济效益。上皮细胞间质样转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)和细胞外基质蛋白(extracellular matrix protein,ECM)过度沉积和结缔组织的增生均可参与多种器官的纤维化。已证实长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)和环状RNA(circRNA)广泛地参与了多种器官的纤维化过程,且lncRNA H19可参与上皮细胞的EMT过程,但H19和circRNA是否参与奶牛乳腺纤维化还未见报道,本研究旨在探究H19在奶牛乳腺纤维化过程中的作用及其机制。研究首先通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测发现H19在炎性乳腺组织中的基因表达水平明显高于正常奶牛乳腺组织中的表达水,进一步通过RT-qPCR检测发现H19在金黄色葡萄球菌毒力成分脂磷壁酸(lipoteichoic acid,LTA)和大肠杆菌毒力成分脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)处理的炎性应答的乳腺上皮细胞中的表达量明显高于正常乳腺上皮细胞,表明H19参与奶牛乳腺上皮细胞的炎性应答过程。为了探究H19在奶牛乳腺纤维化过程的作用,本研究用外源性的TGF-β1处理奶牛乳腺上皮细胞,运用western blot检测上皮细胞EMT标志蛋白和ECM蛋白的表达,结果发现TGF-β1可诱导乳腺上皮细胞EMT发生和ECM蛋白表达上调,同时并通过RT-qPCR发现TGF-β1可以促进H19的升高。随后本研究通过分子克隆技术建立了稳定过表达H19的乳腺上皮细胞系并运用western blot检测发现,在稳定过表达H19的细胞系中EMT标志蛋白及ECM蛋白均明显上调。进一步通过western blot和RT-qPCR探究了H19诱导奶牛乳腺上皮细胞EMT的分子机制。结果显示TGF-β1可促进上皮细胞中PI3K/AKT通路中AKT蛋白的磷酸化,表明TGF-β1处理的乳腺上皮细胞中PI3K/AKT通路被激活;PI3K/AKT特异性抑制剂可抑制该通路的激活,且H19的表达受到抑制,表明TGF-β1可通过PI3K/AKT信号通路的夜激诱导H19表达。在病原菌处理的奶牛乳腺上皮细胞RNA高通量测序结果中,通过生物信息学分析我们发现circRNA可影响细胞增殖、酶活性、细胞迁移和细胞转化等功能,并发现circ0004193与上皮细胞EMT有关。为了探究其与H19的关系,实验建立了稳定过表达circ0004193的细胞系,并运用RT-qPCR检测发现,H19可以促进circ0004193表达且受到其抑制作用。综上所述,在奶牛乳腺上皮细胞中,H19可通过PI3K/AKT信号通路介导TGF-β1诱导的EMT过程且受到circ0004193的负反馈调节,进而在奶牛乳腺炎导致的乳腺纤维化过程中发挥重要作用。