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本文以感染鱼类、引起较大经济损失,并有可能感染人的鲁道夫对盲囊线虫复合种为研究对象,开展其分子鉴定、核糖体序列多态性研究以及线粒体基因多态性和线粒体基因组学研究。
第一部分,对鲁道夫对盲囊线虫的核糖体内转录间隔区(ITS)和序列间隔区(IGS)进行了核苷酸序列的差异和多态性研究。以采自广州动物园鸬鹚体内的鲁道夫对盲囊线虫为研究对象,通过ITS序列分析,确定它为鲁道夫对盲囊线虫B种;在国际上首次报道鲁道夫对盲囊线虫C种的ITS序列,通过种系发育关系分析,为其是一新种的有效性提供了进一步的分子遗传学依据;首次报道了鲁道夫对盲囊线虫A、B和S种的IGS序列,并在IGS序列分析的基础上,建立了多重特异PCR方法用于这3种对盲囊线虫的检测和分子鉴定,为鲁道夫对盲囊线虫的分子检测、鉴别诊断及流行病学调查奠定了基础。以线虫保守引物PCR扩增获得鲁道夫对盲囊线虫B种和C种的ITS序列并对其进行序列分析,结果表明鲁道夫对盲囊线虫的ITS序列具有种内保守、种间差异明显的特点,可作为区分该属线虫不同种的分子标记。鲁道夫对盲囊线虫A、B、C种与北方对盲囊线虫(S种)序列进行比对分析,发现在ITS—1序列碱基差异为1.55%~5.68%;在ITS—2序列的碱基差异为4.33%~11.88%;相比C.septentrionale序列,在34到49位点之间,A种和C种均缺7个碱基,B种缺16个碱基,可见在ITS—2序列差异明显。证明ITS—2序列可作为鉴别鲁道夫对盲囊线虫A、B、C和S种的有效遗传标记。在对IGS序列分析的基础上,设计了鲁道夫对盲囊线虫A、B和S种各自的种特异性引物,将三对引物混合应用,优化反应条件和反应体系,建立了鲁道夫对盲囊线虫A、B和S种的多重PCR鉴定方法,该方法可快速、特异地检测鲁道夫对盲囊线虫感染,敏感度高,最低能检测到0.24ng的鲁道夫对盲囊线虫B种,1.38 ng的鲁道夫对盲囊线虫A种,以及0.51 ng的S种。
第二部分,对鲁道夫对盲囊线虫A、B、C和S种的线粒体cox1、nad1、nad4和rrnS基因的遗传变异情况进行研究,从线粒体基因的角度,开展鲁道夫对盲囊线虫A、B、C和S种各线粒体遗传变异和DNA多态性方面的研究,以期找到研究鲁道夫对盲囊线虫分子分类学、种群遗传关系有效的遗传标记。鲁道夫对盲囊线虫A、B、C和S种的线粒体DNA的四个基因片段种内差异在0.0%~6.0%之间,种间差异在3.3%~18.3%之间,种间差异明显。鲁道夫对盲囊线虫A、B、C和S种之间,线粒体cox1基因的差异为3.3%~12%;nad1基因的差异为9.8%~15.2%;nad4基因的差异为9.6%~18.3%。其种间序列差异nad4>nad1>cox1,这说明nad4基因变异最大,nad1基因次之,而cox1基因变异最小,是相对比较保守的;rrnS基因的差异为3.5%~11.1%,也比较小,与cox1基因变异相近。通过对线粒体cox1、nad1、nad4和rrnS基因序列的多态性分析,显示这些基因可作为鲁道夫对盲囊线虫的种特异的遗传标记。研究结果表明线粒体nad4基因进化较快,存在的种间遗传标记位点最多,比率最高。本论文以3种构树方法进行的系统发育重建显示四个种群:鲁道夫对盲囊线虫A、B、C和S种,NJ和ML法显示A种和C种聚在一起,再与B种聚在一起,然后与S种相聚;而MP法显示A种和B种聚在一起,再与C聚在一起,最后与S种相聚。
第三部分,对鲁道夫对盲囊线虫B种的线粒体基因组进行研究。在分析3个线粒体DNA小片段的基础上,以长PCR方法分三个有重叠序列的片段,扩增了鲁道夫对盲囊线虫B种线粒体全基因组,PCR产物经克隆转化和测序,获得其线粒体基因组全序列并对其特点、结构及与其它线虫的进化关系进行分析,填补了寄生线虫线粒体全基因组相关研究的空白。对鲁道夫对盲囊线虫B种线粒体基因组以长PCR方法进行PCR扩增,得到2个约6.5 kb的mtDNA片段和1个约1.7 kb的片段。经T载体连接,进行克隆转化测序,其测序结果与简单异尖线虫、猪蛔虫、犬弓首蛔虫、猫弓首蛔虫、马来西亚弓首蛔虫、秀丽新杆线虫等进行比对,得到鲁道夫对盲囊线虫B种线粒体DNA完整序列14022 bp。序列分析显示其基因排序方式与简单异尖线虫、猪蛔虫、犬弓首蛔虫、猫弓首蛔虫、马来西亚弓首蛔虫完全一致,同属于GA2型的基因排列。与秀丽新杆线虫、十二指肠钩虫和美洲板口线虫相比,只是AT区的位置不一样,其它基因排序是一样的otRNA的反密码子与简单异尖线虫一样,AT区相对较长(588 bp),这与同属蛔虫目的简单异尖线虫(515 bp)、猪蛔虫(886 bp)、犬弓首蛔虫(975 bp)、猫弓首蛔虫(711 bp)、马来西亚弓首蛔虫(936 bp)相似。通过网上免费软件“串联重复寻找软件”扫描,发现在该线虫AT区有类似于猫弓首蛔虫的串联重复子。将从GenBankTM下载的简单异尖线虫、猪蛔虫等20种线虫及本研究所获得的鲁道夫对盲囊线虫B种的线粒体基因组12种编码蛋白基因氨基酸序列,以肝片吸虫为外群,进行了线虫系统进化分析,所得结果与传统分类系统基本一致,为线虫的系统进化研究奠定了基础。