结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一,其发病率高居世界恶性肿瘤的第三位,死亡率居第四位。到目前为止,对于晚期或已经发生侵润转移的结直肠癌患者来说,有效的治疗措施很有限,故新的低毒高效的化疗药物开发及综合性治疗策略制订显得尤其重要。藤黄酸是藤黄科植物藤黄树脂中的主要活性成分,在过去的半个世纪以来,药理学研究已经揭示了藤黄酸对多种肿瘤显示出了强大的抗肿瘤活性,如白血病、肝癌、头颈部肿瘤、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、宫颈癌和肺癌等。近年来,有报道称藤黄酸在体内、体外均显示出了对结直肠癌细胞显著的抗癌活性。由于藤黄酸具有广谱的抗肿瘤作用,且对体内正常细胞的毒性作用很小,它已经被中国食品和药物管理局批准作为广谱的抗肿瘤药物进行临床试验,目前Ⅱ期临床试验已经完成。但是,有关藤黄酸精细的抗瘤机制目前尚不清楚,还有待进一步研究。在本课题中,我们利用MTT实验结果显示藤黄酸对结直肠癌细胞具有增殖抑制的作用。利用流式细胞术及TUNEL实验结果显示藤黄酸主要是通过caspase-3途径诱导结直肠癌细胞凋亡。在体外细胞实验中,我们利用电子显微镜可观察到藤黄酸可诱导结直肠癌细胞内自噬泡形成；利用吖啶橙染色可观察到藤黄酸诱导结直肠癌细胞内酸性膜泡(Acidic Vesicular Organelles, AVO)的形成；通过外源性转染GFP-LC3,利用荧光显微镜可观察到结直肠癌细胞内自噬斑点聚集现象；利用免疫印迹检测到藤黄酸能诱导结直肠癌细胞内LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化,且具有药物浓度及时间依赖性；利用免疫印迹检测到藤黄酸能诱导结直肠癌细胞内Atg5-Atgl2、Atg7及Beclin1等自噬相关蛋白的表达；通过鼠源的C26细胞建立了小鼠皮下移植瘤模型,每次加药前称量小鼠体重及测量皮下瘤体表面积,处死小鼠后取下瘤块,称量瘤块重量,通过统计学分析可获知藤黄酸具有明显的抑瘤效应；通过免疫印迹及免疫组化检测瘤块中Caspase-3及LC3-Ⅱ表达情况,证实了藤黄酸同样可在体内诱导结直肠癌细胞发生自噬与凋亡。以上实验结果说明藤黄酸在体内、体外都能同时诱导结直肠癌细胞自噬与凋亡发生。利用3-MA或si-Atg5、si-Beclin1抑制细胞自噬发生后,可明显增强藤黄酸诱导的细胞增殖抑制和细胞凋亡,说明细胞自噬在藤黄酸抗瘤过程中对肿瘤细胞起着保护性作用。利用DCFH-DA活性氧检测试剂盒检测到藤黄酸能诱导结直肠癌细胞内ROS积聚,利用NAC抑制细胞内ROS产生后,通过外源性转染GFP-LC3,荧光显微镜下可观察到藤黄酸诱导的自噬斑点明显减少；通过免疫印迹检测到LC3-Ⅱ表达明显减少；这些实验结果说明藤黄酸是通过引发结直肠癌细胞内产生的ROS来诱导细胞自噬发生。通过蛋白组学方法—双向电泳揭示了藤黄酸治疗组改变了多种氧化还原蛋白及脂代谢调节蛋白的表达。为了进一步阐明藤黄酸诱导产生的ROS积聚是否与脂代谢紊乱相关,我们分别通过特异性抑制NADPH氧化酶(NOX)、线粒体氧化呼吸链及LOX来源的ROS抑制剂,利用DCFH-DA活性氧检测试剂盒检测发现藤黄酸引发产生的ROS来源于LOX。我们利用免疫印迹检测p-mTOR, p-Akt及P-P70S6K,证实藤黄酸是通过引发结肠癌细胞内ROS积聚,抑制Akt-mTOR信号通路,从而诱导细胞自噬发生。通过上述实验研究结果表明,藤黄酸作为一种抗癌的天然药物,对结直肠癌细胞具有明显的抑瘤效应；另外,藤黄酸还可同时诱导结直肠癌细胞发生自噬和凋亡,且细胞自噬在藤黄酸抗结直肠癌过程中起着保护性角色,如果在藤黄酸处理结直肠癌细胞的过程中同时抑制细胞自噬发生,藤黄酸的抗瘤效果将会明显增强。藤黄酸诱导细胞自噬发生的分子机制是：通过引发结直肠癌细胞内脂代谢紊乱而产生过多ROS,并通过抑制Akt-mTOR信号通路,从而诱导细胞自噬发生。本课题通过阐明藤黄酸诱导结直肠癌细胞发生细胞自噬的分子机制,为临床上藤黄酸联合细胞自噬抑制剂协同抗瘤提供了理论基础。