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免疫刺激复合物(Immunostimulatory complexes，ISCOMs)是由皂苷、胆固醇、磷脂和抗原构成的抗原提呈系统。ISCOMATRIX佐剂是在ISCOMs基础上发展起来的，其组成和结构本质上和ISCOMs相同，只是不含抗原。ISCOMs和ISCOMATRIX保留皂苷佐剂活性的同时可降低后者的溶血性和毒性。此外，作为一种微粒抗原提呈系统，与抗原和皂苷的简单混合物相比，较少的抗原及皂苷就能诱导机体产生较强的免疫反应。 AJS系从豆科植物合欢Albizzia julibrissin的干燥茎皮中筛选到的佐剂活性皂苷有效部位。前期研究结果表明:AJS对卵清蛋白(OVA)、禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗、猪O型口蹄疫灭活疫苗、猪瘟弱毒活疫苗、猪伪狂犬gE基因缺失活疫苗等均具有显著的佐剂作用，能同时诱生机体对抗原产生Th1和Th2免疫应答反应，且溶血性和毒性低于Quil A，是一种理想的候选疫苗佐剂。鉴于AJS主要成分的化学结构与Quil A相似，均属齐墩果烷型三萜皂苷，苷元的C3、C28位OH糖基化，且含单萜烯酸酯结构，本项目以AJS替代Quil A，研制新型、通用型合欢皮皂苷基质佐剂(Albiziasaponins-based matrix adjuvant，ASMA)，并研究对OVA、猪O型口蹄疫灭活疫苗和猪瘟弱毒活疫苗的佐剂作用，为其进一步的研究开发提供科学依据。 1.ASMA制备工艺研究 以佐剂活性为评价指标，选择膜材比、孵育温度和孵育时间三个关键因素，采用正交试验方法优化ASMA的处方及制备工艺条件:脂药比1∶20、孵育温度37℃及孵育时间3h。 2.ASMA对OVA的佐剂作用 采用模式抗原OVA，以AJS为对照，通过检测免疫小鼠血清中OVA特异性IgG抗体及其亚类效价，从降低抗原及AJS用量角度评价了ASMA对OVA的佐剂活性。结果表明:ASMA显著提高OVA低剂量（2.5μg)受免小鼠血清中OVA特异性IgG及其亚类IgG1、IgG2a和IgG2b的抗体滴度(P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001)，且OVA低剂量联合ASMA高剂量(10μg)免疫小鼠血清中OVA特异性IgG、IgG1、IgG2a和IgG2b抗体滴度显著高于OVA高剂量(25μg)单独免疫组及OVA低剂量(2.5μg)联合AJS免疫(100μg)，说明了ASMA可降低OVA抗原和AJS的使用剂量。 3.ASMA对猪O型口蹄疫灭活疫苗的佐剂作用及其机制 以ICR小鼠为实验动物，以AJS为对照，灭活猪O型口蹄疫病毒(Inactivated type-Ofoot-and-mouth disease virus，IFMDV)单独或联合不同剂量的ASMA皮下注射免疫小鼠，间隔两周加强免疫。二免后14天，处死小鼠，收集血液，分离血清，制备脾细胞悬液。采用间接ELISA检测受免小鼠血清中特异性IgG总抗体及其亚类IgG1、IgG2a和IgG2b的效价;MTT法测定Con A和LPS刺激受免小鼠脾细胞增殖反应及NK细胞活性;RT-PCR法检测受免小鼠脾细胞中细胞因子和转录因子mRNA表达水平。结果表明:ASMA不仅能显著提高IFMDV受免小鼠血清中特异性IgG、IgG1、IgG2a和IgG2b抗体效价(P＜0.001)，而且可增强Con A和LPS刺激的FMDV受免小鼠脾细胞增殖反应(P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001)以及受免小鼠脾脏NK细胞对靶细胞的杀伤活性(P＜0.05或P＜0.01)，上调脾细胞Th1型细胞因子IL-2和IFN-γ，转录因子T-bet、STAT4和Th2型细胞因子IL-4、IL-10，转录因子GATA3、STAT6的基因表达水平(P＜0.001)。 以ICR小鼠为实验动物，以QuilA和AJS为对照，IFMDV单独或联合不同剂量的ASMA皮下注射致敏小鼠，第五天进行激发，12 h后测量小鼠足垫的肿胀情况。结果表明:ASMA各剂量组均可显著促进小鼠对猪口蹄疫病毒(FMDV)诱导的DTH反应，诱导强烈的特异性细胞免疫应答。 以Balb/c小鼠为实验动物，猪O型口蹄疫商品油佐剂疫苗(CFMDV)和AJS为对照，IFMDV单独或联合不同剂量的ASMA皮下注射免疫小鼠，间隔两周加强免疫。二免后14天，处死小鼠，制备腹股沟淋巴结和脾细胞悬液。使用流式细胞术检测了小鼠脾和淋巴结细胞VP1特异性CD4/CD8 T细胞细胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10)表达情况。结果表明:在脾脏和淋巴结中，ASMA组分泌细胞因子的CD4/CD8+T细胞都高于水相疫苗及油苗对照组相，能够诱导Th1/Th2型CD4+T细胞免疫应答以及CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)免疫应答。 上述实验结果说明:ASMA能增强小鼠对IFMDV的体液免疫和细胞免疫反应，对口蹄疫疫苗具有显著的佐剂作用 4.ASMA对猪瘟弱毒活疫苗的佐剂作用 以ICR小鼠为实验动物，Quil A和AJS为对照，猪瘟弱毒活疫苗(兔源，Classical swine fever livevaccine(Rabbit Origin)，SFVR)单独或联合不同剂量的ASMA皮下注射免疫小鼠，间隔两周加强免疫。二免后14天，处死小鼠，收集血液，分离血清，制备脾细胞悬液。采用间接ELISA检测受免小鼠血清中猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)特异性IgG总抗体及其亚类IgG1、IgG2a和IgG2b的效价;MTT法测定Con A和LPS刺激受免小鼠脾细胞增殖反应及NK细胞活性。结果表明:ASMA可显著提高受免小鼠血清中CSFV特异性IgG及其亚类IgG1、IgG2a和IgG2b的抗体滴度(P＜0.01或P＜0.001)。ASMA可显著增强受免小鼠脾脏内NK细胞对靶细胞的杀伤活性(P＜0.05或P＜0.01)。 以ICR小鼠为实验动物，以Quil A和AJS为对照，SFVR单独或联合不同剂量的ASMA皮下注射致敏小鼠，第五天进行激发，12 h后测量小鼠足垫的肿胀情况。结果表明:ASMA可显著促进小鼠对SFVR诱导的DTH反应，诱导强烈的特异性细胞免疫应答。可见，ASMA能显著SFVR受免小鼠体液免疫和细胞免疫应答反应，对猪瘟弱毒活疫苗有显著的佐剂作用。 综上所述，ASMA对OVA、猪口蹄疫灭活疫苗和猪瘟弱毒活疫苗均具有显著的佐剂作用，是一种理想的疫苗候选佐剂。研究结果为ASMA作为疫苗佐剂进一步开展临床试验奠定了基础。