Na⁺-K⁺泵（又称钠泵或Na⁺,K⁺-ATP酶）是P-ATP酶家族的成员,几乎存在于所有的动物细胞膜。Na⁺-K⁺泵通过将3个Na⁺泵出膜外同时泵入2个K⁺所建立的电化学势能为细胞内多种重要的生理功能（控制细胞容量和pH的稳定,营养物质的重吸收等）提供能量。在可兴奋组织（心脏和神经组织等）,Na⁺-K⁺泵对建立和维持正常的电活性发挥关键作用。研究发现,Na⁺-K⁺泵功能可被多种神经内分泌激素及病理状态所引发的生物化学变化调节。例如,儿茶酚胺、胰岛素、甲状腺激素、血管紧张素等通过激活细胞膜上的相应受体和下游的信号转导通路调节泵功能。此外,心肌缺血,做为造成发展中国家人群致死和致残的主要原因,可显著抑制Na⁺-K⁺泵功能。因此,详细阐明体内内源性信号分子和生物化学变化对泵功能的调节有助于更好的理解不同病理生理状态下Na⁺-K⁺泵的确切作用。体内多种信号分子（缓激肽、腺苷、去甲肾上腺素等）对心肌缺血存在不同程度的保护作用,其中腺苷（adenosine,Ado）是研究最为广泛的“心脏保护者”。正常状态下细胞间隙中的腺苷浓度很低,但代谢应激（缺血和缺氧等）可刺激腺苷的大量释放,并与心血管细胞膜表达的腺苷受体(A₁R、A_2AR、A_2BR、A₃R)结合触发细胞内的一系列反应,发挥限制细胞死亡和失功能的作用。腺苷对组织的保护作用涉及不同的机制,包括增加氧供、缺血预适应、刺激血管生成、抑制炎症发生等。然而,Na⁺-K⁺泵作为维持细胞基本功能的主动转移体,其功能是否可被内源性分泌的腺苷调节呢?另外,腺苷能否阻断心肌缺血造成的Na⁺-K⁺泵功能抑制目前仍未见报道。因此,本研究采用全细胞膜片钳的方法旨在观察:（一）腺苷对正常豚鼠心室肌细胞Na⁺-K⁺泵电流的影响,并探讨其可能机制;（二）腺苷对模拟缺血豚鼠心室肌细胞Na⁺-K⁺泵电流的影响;（三）心肌缺血抑制Na⁺-K⁺泵电流的确切机制。第一部分腺苷对正常豚鼠心室肌细胞Na⁺-K⁺泵电流的调节目的:研究腺苷对急性分离的豚鼠心室肌细胞Na⁺-K⁺泵电流的影响,并深入探讨可能参与这一调节过程的信号转导途径。方法:（1）酶解法急性分离豚鼠心室肌细胞:使用Langendorff装置,行主动脉插管逆行灌流（温度、pH、水质恒定）,用胶原酶NB8（Collagenase NB8,Serva公司）消化心脏,急性分离豚鼠心室肌细胞。选择胞膜光滑、横纹相对清晰、贴壁良好、稳定无收缩的细胞用于实验。（2）全细胞膜片钳技术（whole-cell patch-clamp technique）记录Na⁺-K⁺泵电流（Ip）:Na⁺-K⁺泵经过一次主动转运过程将3个Na⁺泵出膜外同时泵入2个K⁺,从而产生一净外向电流。Ip的测定方法是:在特定灌流液和细胞内液成分阻断细胞膜上其它主要离子通道和交换体电流的条件下(K⁺电流、Ca²⁺电流、Na⁺-Ca²⁺交换体电流),灌流细胞特异性、可逆性Na⁺-K⁺泵阻断剂（即强心苷类）,由于Na⁺-K⁺泵被阻断后膜电流产生内向性变化,此差别电流即反映Ip的大小。已有资料证实豚鼠心室肌细胞共表达两种α亚基的Na⁺-K⁺泵,即α1亚基Na⁺-K⁺泵和α2亚基Na⁺-K⁺泵。前者对强心苷的亲和力低,为低亲和力泵;后者对强心苷的亲和力高,为高亲和力泵。例如α1亚基Na⁺-K⁺泵对双氢哇巴因dihydroouabain（DHO,属于强心苷类）的解离常数为72μM,α2亚基Na⁺-K⁺泵对DHO的解离常数为0.75μM,两者亲和力相差100倍。故总泵电流（Ip）为α1亚基Na⁺-K⁺泵电流（Il）和α2亚基Na⁺-K⁺泵电流（Ih）之和:Ip=Il⁺Ih。根据α1和α2亚基Na⁺-K⁺泵对DHO的不同亲和力（5μM DHO阻断89% Ih而仅阻断9% Il,1 mM DHO则阻断几乎全部的Ip）,5μM DHO用于阻断Ih;在记录Il时,所有灌流液中均加入5μM DHO以阻断Ih,此时再灌流细胞1 mM DHO所造成的差别电流即Il。（3）腺苷对Ip影响的测定:实验采用自身对照的方法,即在同一细胞上分别测定对照和腺苷干预时的电流幅度,并以对照电流值标化给药后的电流值求得均数（至少5例细胞）。具体方法如下:破膜后至少稳定5 min使得电极内液和细胞内液充分交换。基线平稳后首先灌流细胞DHO测定对照Ip（Ip（Con））,用正常外液将DHO洗脱后膜电流恢复至初始水平;基线稳定后灌流腺苷,待腺苷引起的膜电流移动不再变化时（表示腺苷作用已经稳定）,用同时含有腺苷和DHO的外液灌流细胞,此时测定的Ip反映腺苷干预后的Ip（Ip（Ado））。最后用Ip（Con）数值标化Ip（Ado）求得均数（Ip（Ado）/Ip（Con））。这种方法的优点在于避免了不同的细胞大小和泵蛋白表达量（即蛋白密度）造成的差异。（4）细胞内信号机制的鉴别:实验选用特异性腺苷A1R、A2AR、A3R激动剂（分别为CCPA、CGS21680、Cl-IB-MECA）和拮抗剂（分别为DPCPX、SCH58261、MRS1191）,PKC拮抗剂（Staurosporine和bisindolylmaleimide I）,PKA拮抗剂（H89）鉴别可能参与这一调节作用的腺苷受体亚型和信号通路。药物浓度的选择均参照文献报道。结果:（1）腺苷特异性抑制Ih。生理浓度的腺苷（1 nM）显著抑制Ih,抑制率为39±0.04%（P<0.05）。洗脱腺苷和DHO后电流幅度能恢复到对照水平,这种“recontrol”的实验方法排除了泵电流衰减的可能性。相反,1 nM腺苷不影响Il,Il为对照水平的93±0.05%（P>0.05）,且增加腺苷浓度至10-5 M也不影响Il,以上实验结果表明腺苷特异性调节Ih。（2）腺苷对Ih的抑制呈剂量依赖性。10-11-10-5 M腺苷剂量依赖性的抑制Ih（8-47%）,腺苷浓度为10-8 M时产生最大抑制作用。（3）腺苷对Ih的抑制呈电压非依赖性。首先设置钳制电压为0 mV,然后在灌流DHO前后分别给予从+20至-100 mV的电压ramp protocol,两组数据相减即可得到泵电流的Ih-Vm关系曲线。之后在灌流细胞腺苷的情况下,再次于灌流DHO前后施加上述电压ramp protocol,两组数据相减即为腺苷作用后的Ih-Vm关系曲线。为便于比较灌流腺苷前后的Ih-Vm关系,特将对照和灌流腺苷后各电压下的电流值用0 mV的电流值进行标化。结果表明,在各电压下腺苷对Ih均产生约47%的抑制,即腺苷对Ih的抑制不具有电压依赖性。（4）腺苷通过激活A1R触发对Ih的抑制。同时灌流细胞腺苷和特异性A1R拮抗剂DPCPX（10 nM）时,Ih可恢复至对照电流值的96±0.06%（P>0.05）。另外,特异性A1R激动剂CCPA（10 nM）可模拟腺苷对Ih的抑制,抑制率为50±0.04%（P<0.05）,以上结果提示腺苷通过激活A1R抑制Ih。此外,特异性A2AR和A3R激动剂CGS21680（0.2μM）和Cl-IB-MECA（0.5μM）不影响Ih,Ih分别为对照电流值的101±0.07%（P>0.05）和98±0.05%（P>0.05）,并且腺苷和特异性A2AR和A3R拮抗剂SCH58261和MRS1191（均为0.1μM）同时灌流也不影响腺苷对Ih的抑制,抑制率为53±0.06%（P<0.05）,与单独灌流腺苷时的抑制率（47±0.03%）相比无统计学差异（P>0.05）。结果提示A2AR和A3R不参与腺苷对Ih的抑制。（5）腺苷A1R激活后经PKC通路抑制Ih。PKC阻断剂Staurosporine（St,1.5μM）可拮抗腺苷对Ih的抑制,Ih可恢复至对照水平的95±0.05%（P>0.05）。另外,特异性更强的PKC阻断剂bisindolylmaleimide I（Bis- I,1μM）也产生与St相同的作用,Ih恢复至对照水平的91±0.04%（P>0.05）。相反,PKA阻断剂H89（1μM）不影响腺苷对Ih的抑制,抑制率为47±0.03%（P<0.05）。结果提示腺苷A1R激活后经PKC通路抑制Ih。（6）PKC-δ是介导腺苷作用的具体PKC亚型。经典PKC亚型（PKC-α,β,γ）阻断剂G?-6976（100 nM）不影响腺苷对Ih的抑制,抑制率为53±0.05%（P<0.05）。相反,特异性PKC-δ抑制剂rottleri（n10μM）可完全阻断腺苷的作用,Ih恢复至对照水平的91±0.05%（P>0.05）。另外,特异性PKC-δ转位激活肽PP114（200 nM）可显著抑制Ih,抑制率为52±0.04%（P<0.05）,且其作用也可被Bis-1和rottlerin阻断。结果提示PKC-δ是介导腺苷作用的主要PKC亚型。结论:腺苷对正常豚鼠心室肌细胞Na⁺-K⁺泵存在亚基特异性的调节作用,即腺苷特异性抑制高亲和力α2亚基Na⁺-K⁺泵电流。这一作用是经腺苷A1R和PKC通路介导,腺苷A2AR、A2BR、A3R和PKA通路不参与腺苷对Na⁺-K⁺泵的调节。第二部分腺苷对缺血豚鼠心室肌细胞Na⁺-K⁺泵电流的调节目的:已知心肌缺血可导致Na⁺-K⁺泵活性的显著降低,但在单细胞水平上鲜有文献研究缺血对Na⁺-K⁺泵电流的影响,因此本研究旨在详细描述缺血对心肌Na⁺-K⁺泵电流的抑制和电流特性的变化,以及观察腺苷处理能否拮抗心肌缺血对Na⁺-K⁺泵电流的抑制。方法:（1）酶解法急性分离豚鼠心室肌细胞:同第一部分。（2）全细胞膜片钳方法记录Na⁺-K⁺泵电流（Ip）:同第一部分。（3）使用代谢抑制剂模拟缺血状态:代谢抑制（metabolic inhibition,简称MI）是心肌缺血的主要特征,因此使用糖酵解抑制剂2-DG和线粒体解偶联剂FCCP可造成糖酵解和氧化磷酸化的联合抑制。结果:（1）MI时间依赖性的抑制Ip。MI灌流2.5,4,6 min后,电流幅度分别被抑制了30±0.05%,49±0.02%,62±0.04% （r=0.82,P<0.05）。延长灌流时间至10 min时,MI对Ip的抑制程度并不产生进一步的增加（67%±0.02,P>0.05）。结果表明,MI对Ip的抑制呈时间依赖性,且MI灌流时间为6 min时对Ip产生最大抑制作用。（2）Antimycin A抑制Ip。为证实MI对Ip的抑制作用是代谢抑制的结果,实验选用另一种代谢抑制剂antimycin A,后者通过抑制呼吸链电子的传递过程造成代谢抑制。结果表明,10μM antimycin A也可显著抑制Ip,抑制率为68±0.02%（P<0.05）。（3）MI特异性抑制Il。MI灌流6 min后,Ih仍维持在对照水平的97±0.04%（P>0.05）,提示MI对泵电流的抑制可能只涉及α1亚基Na⁺-K⁺泵。进而我们直接观察MI对Il的作用。结果表明,MI明显抑制Il,抑制率为60±0.03%（P<0.05）,与MI对总泵电流的抑制率（62±0.04%）相比无统计学差异（P>0.05）,提示MI特异性抑制α1亚基Na⁺-K⁺泵。（4）MI对Ip的抑制呈电压依赖性。Ip-Vm关系的测定方法同第一部分,仅以毒毛旋花子苷原strophanthidin（St,属于强心苷类）代替DHO作为Na⁺-K⁺泵阻断剂。结果表明,灌流MI前后V1/2数值分别是-107和-87 mV,即MI造成Ip-Vm曲线向正电压轴方向偏移了20 mV,两条曲线有统计学差异（P<0.05;two-way ANOVA）。（5）腺苷不影响MI对Ip的抑制。在10μM腺苷存在时,MI仍可对Ip产生66±0.05%（P<0.05）的抑制;与不存在腺苷时的抑制率（62±0.04%）相比无统计学差异（P>0.05）。甚至使用100μM的腺苷（临床治疗缺血性心脏疾病时的剂量）也不产生作用,提示腺苷不能阻断缺血对泵电流的抑制,即Na⁺-K⁺泵可能不参与腺苷对心肌缺血的保护作用。结论:模拟心肌缺血显著抑制豚鼠心室肌细胞Na⁺-K⁺泵电流,呈时间依赖性。模拟心肌缺血对Na⁺-K⁺泵电流的抑制也具有亚基特异性,即缺血特异性抑制低亲和力α1亚基Na⁺-K⁺泵电流,且此作用呈电压依赖性。腺苷不影响模拟心肌缺血对泵电流的抑制,提示Na⁺-K⁺泵可能不参与腺苷对心肌缺血的保护作用。第三部分心肌缺血抑制Na⁺-K⁺泵电流的机制研究目的:阐明心肌缺血造成Na⁺-K⁺泵电流抑制的可能机制。方法:（1）酶解法急性分离豚鼠心室肌细胞:同第一部分。（2）采用全细胞膜片钳技术测定Na⁺-K⁺泵电流（Ip）:同第一部分。（3）使用代谢抑制剂模拟缺血状态:同第二部分。（4）细胞内pH（pHi）的检测:使用对pH敏感的双激发荧光染料carboxy-SNARF-1检测pHi。carboxy-SNARF-1负载细胞10 min后使用激光共聚焦显微镜检测荧光信号,激发波长514nm,并于580 nm和640 nm处同时检测荧光信号。pHi的变化由上述两种波长荧光强度的比值（F580/F640）所反映。580的荧光值代表细胞内已结合的H+,640的荧光值代表细胞内未结合的H+,其比值的变化可反应出pHi的变化。通过nigericin calibration technique将F580/F640比值转化为pHi。结果:（1）心肌缺血造成的细胞内酸化可抑制Ip。心肌缺血引起细胞外环境的许多变化,如缺氧、葡萄糖耗竭及酸中毒等。但实验结果表明,若维持细胞外液pH稳定（pHo 7.4）,仅单纯缺氧（灌流液充以100% N2）和耗竭葡萄糖（以等摩尔的蔗糖代替葡萄糖）时,Ip仅被抑制了7.5±0.04% （P>0.05）;相反,若仅降低灌流液pH值而不改变葡萄糖和氧含量,即采用酸性灌流液（pHo 6.0,常氧,含糖）灌流心肌细胞,则可显著抑制Ip,且抑制程度与MI相似,为50±0.02%（P<0.05）,提示细胞外酸中毒是造成Ip抑制的触发因素。由于细胞外酸中毒可迅速引起细胞内的酸化,且有资料报道Na⁺-K⁺泵对pHo不敏感,这些证据提示pHi可能是心肌缺血抑制Ip的主要介导因素。为验证这一设想,我们将电极内液中HEPES浓度增加至20 mM,从而提高HEPES对pH变化的缓冲能力。结果表明,在内液中含有高浓度HEPES的情况下,酸性灌流液（pHo 6.0）不引起明显的Ip抑制;Ip为对照水平的94±0.07%（P>0.05）。相反,通过灌流细胞酸性制剂造成细胞内酸化可模拟细胞外酸中毒对Ip的抑制。短暂灌流并洗脱NH4Cl是造成细胞内酸化的常规方法。结果表明,短暂灌流15 mM NH4Cl并洗脱后（3 min）,Ip可被明显抑制,抑制率为60±0.03%（P<0.05）。同样,在内液中存在20 mM HEPES时,这一作用可被完全阻断,Ip恢复至对照水平的96±0.04%（P>0.05）。以上结果提示,细胞内酸化是心肌缺血抑制Ip的主要介导因素。（2）MI引起细胞内酸化,从而抑制Ip。在内液中存在20 mM HEPES时,MI对Ip的抑制作用被明显阻断,Ip恢复至对照水平的81±0.02%,但与内液中含有5 mM HEPES时的抑制率相比（62±0.04%）仍有统计学差异（P<0.05）。为明确pHi的作用,我们使用对pHi敏感的荧光染料在共聚焦显微镜下直接观察MI灌流前后pHi的变化。结果显示,MI灌流前pHi约为7.28±0.07,MI灌流后pHi呈时间依赖性的下降;MI灌流2.5,4,6 min时,pHi分别分别下降至7.02±0.06,6.81±0.06和6.65±0.08。以上结果提示,细胞内酸化是代谢抑制时Ip被抑制的主要介导因素。（3）氧化应激（ROS）、PKA和PKC不参与MI对Ip的抑制。电极内液中加入1 mM MPG不影响MI对Ip的抑制（68±0.05%）,与内液中不含MPG的抑制率（62±0.04%）相比无统计学差异（P>0.05）。另外,特异性PKA阻断剂H89（1μM）或PKC阻断剂Bis-I（1μM）也不影响MI对Ip的抑制。结论:模拟心肌缺血通过造成细胞内的酸化从而抑制Na⁺-K⁺泵电流。心肌缺血对泵电流的抑制可能不涉及缺血造成的其它细胞内变化,例如ROS,PKA和PKC的激活以及缺氧、葡萄糖耗竭等。结论1腺苷对正常豚鼠心室肌细胞Na⁺-K⁺泵存在亚基特异性的调节作用,即腺苷特异性抑制高亲和力α2亚基Na⁺-K⁺泵电流。这一作用是经腺苷A1R和PKC通路介导,腺苷A2AR、A2BR、A3R和PKA通路不参与腺苷对Na⁺-K⁺泵的调节。2模拟心肌缺血显著抑制豚鼠心室肌细胞Na⁺-K⁺泵电流,呈时间依赖性。模拟心肌缺血对Na⁺-K⁺泵电流的抑制也具有亚基特异性,即缺血特异性抑制低亲和力α1亚基Na⁺-K⁺泵电流,且此作用呈电压依赖性。腺苷不影响模拟心肌缺血对泵电流的抑制,提示Na⁺-K⁺泵可能不参与腺苷对心肌缺血的保护作用。3模拟心肌缺血通过造成细胞内酸化抑制Na⁺-K⁺泵电流。心肌缺血对泵电流的抑制可能不涉及缺血造成的其它细胞内变化,例如ROS,PKA和PKC的激活以及缺氧、葡萄糖耗竭等。