【摘 要】
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目的:越来越多的研究发现成骨细胞对造血干细胞的发育调控发挥重要的作用,一旦成骨细胞受损,导致小鼠骨骼以及骨髓增生异常,主要包括HSCs克隆性增殖、血细胞计数下降、B淋巴细胞生成与巨核细胞发育异常,最终引起一些的疾病发生,如骨髓急性白血病。树突状细胞是目前抗原呈递能力最强的细胞,在适应性免疫和固有免疫中均发挥着重要作用,但到目前为止成骨细胞谱系对树突状细胞的分化发育还暂不明确。本课题旨在探究成骨细胞
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目的:越来越多的研究发现成骨细胞对造血干细胞的发育调控发挥重要的作用,一旦成骨细胞受损,导致小鼠骨骼以及骨髓增生异常,主要包括HSCs克隆性增殖、血细胞计数下降、B淋巴细胞生成与巨核细胞发育异常,最终引起一些的疾病发生,如骨髓急性白血病。树突状细胞是目前抗原呈递能力最强的细胞,在适应性免疫和固有免疫中均发挥着重要作用,但到目前为止成骨细胞谱系对树突状细胞的分化发育还暂不明确。本课题旨在探究成骨细胞谱系对树突状细胞发育与生物学特性的影响及其分子机制。具体目标:（1）通过条件性基因敲除技术,研究小鼠体内Hedgehog通路中负调控因子sufu（Fu抑制剂）在调控骨代谢中的作用;（2）探索条件性敲除成骨细胞谱系中sufu基因的小鼠（Osx-Cre;sufufl/fl）的骨髓、脾脏和淋巴结内树突状细胞（DC）的比例与生物学特性,并初步探索其机制;（3）分析成骨谱系Hedgehog信号异常影响DC分化发育的分子机制。方法:（1）构建sufu敲基因小鼠（Osx-Cre;sufufl/fl）,通过比较野生对照组（Osx-Cre）和sufu敲基因小鼠体型,Micro-CT扫描分析骨质和H＆E染色等检测小鼠骨质是否发生异常;qRT-PCR和WB检测骨组织成骨分化相关基因或蛋白的表达以及流式分析骨髓内成骨细胞的比例。（2）构建R26-mTmG和Osx-Cre;R26-mTmG小鼠并观察骨组织、脾脏和淋巴结内osterix+细胞的分布;流式分析野生对照组和sufu敲基因小鼠骨髓、鼠脾脏与淋巴结内树突状细胞（DC）、常规树突状细胞（cDC）和浆细胞样树突状细胞（pDC）的比例,并对其计数;分选骨髓内cDC和pDC进行活化后与CD4+T细胞共培养以及qRT-PCR检测cDC和pDC的基因表达差异;流式和体外诱导DC检测骨髓内造血干细胞的比例与功能的差异。（3）基因测序检测野生对照组和sufu敲基因小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）基因表达的差异,qRT-PCR与WB检测野生对照组和sufu敲基因小鼠骨组织WIF1的表达,流式与qRT-PCR检测骨髓内c-kit细胞内β-catenin的表达,检测Wnt/β-catenin信号的抑制剂（ICG001）对体外诱导DC的比例的影响并探索Hh信号与Wnt/β-catenin信号通路的关系。结果:（1）sufu敲基因小鼠的体型与体重显著性小于野生对照组小鼠,Micro-CT扫描和H＆E染色分析结果表明,与野生对照组小鼠相比,sufu敲基因小鼠发生了严重的骨质疏松;骨组织qRT-PCR和WB结果显示,sufu敲基因小鼠骨组织的成骨分化基因和蛋白的表达均显著低于野生对照组小鼠,流式分析显示sufu敲基因小鼠骨髓内成骨细胞的比例和数量显著性低于对照组小鼠。（2）通过切片观察到在骨髓内存在大量的osterix+细胞,脾脏髓质内也存在一定的osterix+细胞,而淋巴结仅仅在皮质部分存在少量的osterix+细胞;流式结果显示与野生对照组小鼠相比,sufu敲基因小鼠骨髓、脾脏内pDC的比例和数量均减少,骨髓内cDC的比例也显著性下降;野生对照组和sufu敲基因小鼠骨髓内活化cDC和pDC与CD4+T细胞共培养,结果显示对照组小鼠骨髓内cDC的功能与sufu敲基因小鼠cDC功能无差异,但sufu敲基因小鼠骨髓内pDC对诱导CD4+T的能力明显弱于野生对照组;骨髓内cDC和pDC的qRT-PCR结果显示,sufu敲基因小鼠cDC与pDC的DC分化相关的基因小于对照组,功能相关基因的表达也低于野生对照组,sufu敲基因小鼠骨髓内造血干细胞（HSCs）的比例明显低于野生对照组,野生对照组小鼠体外诱导可以得到更多的DC细胞,但是其亚群（CD11b+DC和B220+DC）之间的比例无差异,且功能也无差异。（3）基因测序结果显示与野生对照组相比,sufu敲基因小鼠的BMSCs高表达WIF1基因,sufu敲基因小鼠的骨组织高表达WIF1基因与蛋白,其Wnt信号被抑制,sufu敲基因小鼠骨髓内c-kit细胞的β-catenin的表达量与Wnt/β-catenin相关的基因的表达显著性低于野生对照组,Wnt/β-catenin（ICG001）不会抑制DC的生成,但会明显抑制pDC的生成,qRT-PCR和WB检测显示Hh信号的抑制促进了Wnt/β-catenin信号通路的激活。结论:（1）条件性敲除osterix细胞中的sufu导致小鼠成骨发育异常一引起小鼠发生严重的骨质疏松。（2）sufu敲基因小鼠骨髓内pDC的比例和功能异常,且骨髓内HSCs的比例异常。（3）sufu敲基因小鼠的骨髓间充质干细胞高表达WIF1,导致骨髓内微环境中WIF1增加,抑制造血干细胞的Wnt/β-catenin信号通路,导致pDC的生成减少。
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