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目的:体外分离和培养人脐血间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells fromUmbilical Cord Blood,UCB-MSCs),对其生物学特性进行鉴定。将含有胶质源性神经营养因子(Glial cell derived neurotrophic factor,GDNF)的慢病毒载体转染UCB-MSCs,初步评价基因转染后UCB-MSCs生物学功能变化,探讨GDNF在UCB-MSCs中表达水平。
方法:通过密度梯度离心法从脐血中分离单核细胞,通过贴壁培养和控制消化时间得到形态较均一的长梭形细胞,流式细胞仪(fluorescence activated cellsorting,FACS)检测其细胞表面标记,并诱导其向脂肪方向分化,对UCB-MSCs的生物学特性进行鉴定。同时将GDNF基因克隆入慢病毒载体,包装出病毒上清,以不同拷贝数转染UCB-MSCs,通过检测细胞表面抗原、观察细胞的形态学、增殖分化能力的差异,初步评价基因转染对细胞生物学功能的影响,用酶联免疫吸附实验(ELISA)和实时定量多聚合酶链反应(real-time polymerase chainreaction,real-time PCR)技术分别测定不同转染组GDNF的蛋白及mRNA表达水平。
结果:采用密度梯度离心法成功在体外分离和培养UCB-MSCs,并诱导其向脂肪细胞分化。FACS检测结果显示,UCB-MSCs中CD90、CD73及CD105蛋白表达阳性,CD14、CD34、CD45、CD19、HLA-DR、Stro-1及CD106蛋白表达阴性。ELISA和real-time PCR检测结果显示,用含GDNF基因的慢病毒载体转染UCB-MSCs后,其GDNF蛋白分泌量和mRNA表达水平与转染拷贝数有关,转染拷贝数越高,GDNF的表达量越高。GDNF基因转染后UCB-MSCs原有的生物学功能无明显改变。
结论:成功在体外分离和培养UCB-MSCs。用含有GDNF基因的慢病毒载体的转染UCB-MSCs可通过转染拷贝数在一定水平上控制GDNF的蛋白分泌量和mRNA的表达水平,使其持续高表达GDNF。