理想的植物株型塑造有利于提高作物产量,人们通过果树剪枝提高坐果率,通过增加水稻和小麦的分蘖数来提高产量。植物地上部分的形态主要由植物的分枝发育决定,植物的分枝发育主要经历三个阶段:首先是侧分生组织的起始,主要受遗传因子的调控;然后是腋芽的形成和腋芽的生长与休眠,主要由植物的发育进程、外界环境和一些植物激素(如生长素、细胞分裂素、独脚金内酯等)共同决定。烟草是一种以收获叶为生产原料的经济作物,它的株型单一,分枝方式为单轴分枝。在烟草的营养生长阶段,受顶端优势的抑制,其腋芽并不生长。当烟草由营养生长阶段转变为生殖生长阶段时,顶端优势减弱,且在烟草的实际生产中要对其进行打顶。烟草打顶后,顶端优势解除导致叶腋生长素浓度降低,而细胞分裂素浓度升高,促进了腋芽的生长,形成新的分枝。腋芽的生长不利于老叶营养物质的积累,会降低烟叶的商业价值,所以要对其进行抹芽。烟草的打顶抹芽是一项费时耗力的工作,基于此本研究希望通过CRISPR/Cas9基因编辑的方法对烟草侧分生组织形成的相关基因(las,bl,rev)进行敲除,以期获得打顶后腋芽减少生长的突变体,并进行相应的基因功能研究,对以后培育打顶后可自行抑芽的烟草品种提供理论基础。主要获得的研究结果如下:1.通过同源比对和蛋白功能域分析从烟草基因组中鉴定到9个HD-Zip Ⅲ转录因子家族成员,分别命名为NtHB1～NtHB9,其中NtHB6和NtHB9与rev的同源性最高,分别为79.88%和80.24%。通过同源比对和进化分析,从烟草基因组中鉴定到两个las的同源基因Ntlas1和Ntlas2。从NCBI上下载了烟草中bl的同源基因Ntrax1和Ntrax2。设计引物克隆了NtHB6/NtHB9,Ntlas1/Ntlas 和Ntrax1/Ntrax2的CDS序列并进行序列分析。2.根据目标基因的基因结构和CDS序列,每个基因设计了 3个编辑的靶位点,其中rev的第一个和第三个靶位点为NtHB9上的序列,第二个靶位点为NtHB6/NtHB9的共同序列;构建了单基因敲除载体和双基因敲除载体共计12个;通过农杆菌介导的遗传转化法侵染野生型烟草红花大金元叶片,经历愈伤诱导后获得再生植株;再生植株靶位点突变检测结果显示每个基因都成功获得了突变体,突变形式为碱基的删除、插入和替换,套袋自交获得T1代突变体。3.成功获得单基因敲除突变株7株,双基因敲除突变株5株。我们对其中的一些突变体进行了分析,突变位点分析结果显示:rev2-4和rev2-6都检测到了NtHB6/NtHB9双基因突变,碱基的删除和插入导致基因编码提前终止,蛋白结构域预测其不能形成MEKHLA结构域,而这个结构域是rev所属亚家族特有的结构域,它在蛋白二聚化过程中具有很重要的作用;rev1-3检测到了NtHB 单基因突变,碱基的删除使得氨基酸序列第34和35位出现氨基酸的删除和替换,蛋白结构域预测并未对蛋白编码产生较大影响;las2-1为单基因突变体,其碱基的删除导致基因编码提前终止。4.在获得的T1代突变体中,rev2-6突变表型明显,其纯合突变体顶芽发育缺陷,停留在两片子叶的发育状态,或顶端发育出数量不一的异形叶。异形叶的形状一般为圆形、喇叭状、不对称扇形,叶脉发育不完全。顶芽发育缺陷的突变株根基本不发育,顶端发育出异形叶的突变株能发育出少量根。Rev1-3的纯合突变体正常生长,且在打顶10天、20天、30天后腋芽生长数目较野生型并没有很大差异。Rev2-4均为杂合体,正常生长,但在打顶10天、20天、30天后腋芽的平均生长数目均低于野生型。5.通过突变体rev2-6的研究,对NtHB6/NtHB9影响烟草发育的多效性进行了分析。其影响包括以下几个方面:①对顶端分生组织的影响,顶芽发育缺陷,顶端分生组织发育相关基因表达量变化显著。②对非顶端分生组织的影响,异型叶表面生长出凸起的组织或叶状体,叶片厚度明显增加,单位叶面积重量增加。通过扫描电镜对突变体叶表面进行观察,发现叶片腺毛数量明显减少,表皮细胞明显增大。③对叶片发育的影响包括3个方面:首先是叶片不能建立正常的叶极性,发育出异形叶,且和叶片极性建立相关的基因表达量变化显著;其次是不能发育出完整的叶脉,叶脉维管束变小;最后叶片的代谢物质总糖、总蛋白、叶绿素、类胡萝卜素含量降低。