目的幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, Hp)是一种可长期定植于胃粘膜的革兰阴性微需氧菌。Hp不仅是引起萎缩性胃炎和胃溃疡等慢性炎症的致病因子，而且与胃癌和胃黏膜相关淋巴样组织淋巴瘤等恶性疾病的发生密切相关。近年来，大量的研究表明Hp可以侵入胃粘膜上皮细胞，但Hp侵袭胃上皮细胞的机制未知，与疾病的相关性也未知。本课题研究不同消化系统疾病来源的Hp对AGS细胞的侵袭作用及Hp侵袭AGS细胞对细胞功能的影响，探讨Hp的侵袭力与致病的相关性，旨在进一步明确Hp的致病机理。方法1、幽门螺杆菌对AGS细胞的侵袭作用1.1幽门螺杆菌对AGS细胞的侵袭率：采用庆大霉素保护侵袭实验，用Hp标准株NCTC11637（cag PAI+、VacA+）、SS1（无cag PAI功能）和75株临床分离株（来源于胃炎30株、胃溃疡25株、胃癌20株）感染AGS细胞（MOI=50:1）,2h后用含庆大霉素的细胞培养液（庆大霉素浓度为100μg/ml）洗涤并用含庆大霉素的培养液（庆大霉素浓度为25μg/ml）维持培养。分别在感染4h和12h后裂解细胞，将裂解液梯度稀释后涂布于布氏血琼脂平板，培养6d后进行菌落计数。通过计数Hp感染细胞4h后细菌量作为侵入细胞的细菌数，Hp的侵袭率=侵入细胞的细菌数/感染细胞的细菌数×100%；感染12h后的细菌量作为Hp在细胞内的繁殖量。1.2幽门螺杆菌作用AGS细胞的侵袭粘附比：以上述同样的菌株感染AGS细胞（MOI=50:1）,感染2h后洗涤并裂解细胞，将裂解液梯度稀释后涂布于布氏血琼脂平板，培养6d后进行菌落计数，此数据为粘附的细菌数；感染2h后用含庆大霉素的细胞培养液（庆大霉素浓度为100μg/ml）洗涤，并用含庆大霉素的培养液（庆大霉素浓度为100μg/ml）继续维持培养2h，洗涤并裂解细胞，同样的方法进行菌落计数，此数据为侵入的细菌数；计算Hp的侵袭粘附比，侵袭粘附比=侵入的细菌数/粘附的细菌数。1.3检测幽门螺杆菌在细胞内的存活时间：Hp SS1感染AGS细胞（MOI=10:1），庆大霉素（25μg/ml）维持培养，分别在感染后24h、36h、48h、72h、4d、5d裂解细胞，将裂解液梯度稀释后涂布于布氏血琼脂平板，培养6d后进行菌落计数。1.4观察幽门螺杆菌对AGS细胞的侵袭过程： Hp NCTC11637感染AGS细胞（MOI=100:1）2.5h、4h、6h、12h、24h，PBS洗涤后收集细胞，经固定、脱水、包埋，制成超薄切片，透射电镜下观察Hp侵袭的情况。NCTC11637感染AGS细胞（MOI=50:1）2.5h、4h、6h后，以兔抗Hp外膜蛋白（OMP）抗体为一抗，以荧光标记羊抗兔抗体为二抗，标记Hp外膜，并用DAPI染色标记Hp染色质和细胞核，激光共聚焦显微镜（Leica TCS SP5）下观察Hp侵袭的情况。2、不同侵袭力幽门螺杆菌毒力基因的检测选择NCTC11637、SS1、3株高侵袭力临床分离株、3株低侵袭力临床分离株，用High Pure PCR Template Preparation Kit基因组提取试剂盒，提取Hp基因组DNA，以此为模板， PCR检测Hp主要毒力基因cagA、vacA、cagE、babA、iceA，并对cagA3′端基因测序， Bioedit分析软件分析cagA-EPIYA分型，分析Hp毒力基因与侵袭力的相关性。3、幽门螺杆菌侵袭AGS细胞对细胞功能的影响3.1阻断剂阻断Hp侵袭AGS细胞选择0、2.5μg／ml、5μg／ml三个不同浓度梯度的两种阻断剂——细胞膜表面抗β1整合素抗体和细胞松弛素D（肌动蛋白聚合阻断剂），分别预处理细胞40min和4h后，将Hp（标准株NCTC11637和SS1、3株高侵袭力临床株和3株低侵袭力临床株）作用AGS细胞30min，用含庆大霉素的培养液（庆大霉素浓度为100μg/ml）洗涤后裂解细胞，涂布于布氏血琼脂平板并进行菌落计数。3.2Hp侵袭AGS细胞对细胞增殖的影响NCTC11637以不同感染密度（MOI=16:1，32:1，62.5:1，125:1）作用AGS细胞，分设细胞松弛素D未处理组（A组）和细胞松弛素D预处理组（B组，5μg／ml细胞松弛素D预先处理细胞4h），A组以无细菌感染的常规培养AGS细胞为对照组（ControlA)，B组以无细菌感染并经细胞松弛素D预处理的AGS细胞为对照组（Control B)。作用2d后CCK-8方法检测AGS细胞的增殖情况，计算细胞的增值率，增殖率（PI）=(A组OD－ControlAOD)/ControlAOD×100%，或(B组OD－Control B OD)/Control B OD×100%。3.3Hp侵袭AGS细胞对细胞凋亡的影响NCTC11637以不同感染密度（MOI=16:1，32:1，62.5:1，125:1）作用AGS细胞，分设细胞松弛素D未处理组（A组）和细胞松弛素D预处理组（B组，5μg／ml细胞松弛素D预先处理细胞4h），A组以无细菌感染的常规培养AGS细胞为对照组（ControlA)，B组以无细菌感染并经细胞松弛素D预处理的AGS细胞为对照组（Control B)。作用2d后TUNEL法检测AGS细胞的凋亡，显微镜下观察A、B两组细胞的凋亡变化，分别计数A、B两组凋亡细胞并计算细胞的凋亡率，凋亡率（AI）=视野内的凋亡细胞数/视野内的细胞总数×100%。结果1、幽门螺杆菌对AGS细胞的侵袭作用NCTC11637的侵袭率（0.04%）高于SS1的侵袭率（0.012%）。胃癌和胃溃疡来源的Hp平均侵袭率分别为0.027%±0.003%和0.028%±0.007%，均高于胃炎来源的Hp平均侵袭率0.010%±0.001%，P均小于0.05，表明Hp对AGS细胞侵入的强度与疾病的严重程度正相关。Hp侵入AGS细胞12h后在细胞内繁殖，细菌数量成倍增长，胃炎组、胃溃疡组、胃癌组以及NCTC11637细菌繁殖量依次增加。不同疾病来源的Hp侵袭粘附比在10%～15%之间，各株之间相比差异无显著性，对细胞粘附能力强的菌株侵袭率也高，表明Hp对AGS细胞的侵袭能力与细菌粘附能力正相关。Hp作用AGS细胞4d后，仍可在胞内检测到Hp，表明Hp侵入细胞后在胞内的存活时间为4d。透射电镜下可见Hp粘附细胞，通过细胞内吞作用进入胞内并在细胞内分裂增殖。激光共聚焦显微镜下可见Hp粘附并侵入细胞，随感染时间延长可见Hp在细胞内数量增加，表明Hp可以侵入AGS细胞，并在细胞内繁殖。2、不同侵袭力幽门螺杆菌毒力基因的检测对Hp标准株NCTC11637和SS1、3株高侵袭力临床株和3株低侵袭力临床株进行基因背景分析，8株细菌cag PAI毒力基因cagA、cagE检测均为阳性；主要粘附基因babA和iceA均为R+R067型和iceA1型；SS1的vacA基因型为s2/m2型，为空泡毒素弱毒力株，其余被测菌株均为s1/m1型，为强毒力株；cagA-EPIYA分型均为cagA-EPIYA-ABD型。提示被测主要毒力基因与Hp的侵袭强度无关。3、幽门螺杆菌侵袭AGS细胞对细胞功能的影响3.1、阻断剂阻断Hp侵袭AGS细胞：应用抗β1整合素抗体和细胞松弛素D（肌动蛋白聚合阻断剂）处理细胞后，均呈剂量依赖阻断Hp对细胞的侵入，两种阻断剂阻断浓度为5μg／ml时，效果最显著，细胞松弛素D阻断率为60%-80%，抗β1整合素抗体阻断率为40%-70%，细胞松弛素D阻断作用强于抗β1整合素抗体；激光共聚焦显微镜下可见经抗β1整合素抗体作用后HpNCTC11637侵入细胞数量减少。3.2、Hp侵袭AGS细胞对细胞增殖的影响：A组（细胞松弛素D未处理组）和B组（细胞松弛素D预处理组）分别与对照Control A（无细菌感染的常规培养AGS细胞）和Control B（无细菌感染并经细胞松弛素D预处理的AGS细胞）比较后，两组均具有促进AGS细胞增殖的作用，当MOI=32:1时，A组促增殖作用最为明显，其OD值为2.551±0.046，细胞增殖率达95.95%±3.56%，明显高于B组增殖率42.86%±2.85%，两组间具有明显统计学差异，P<0.05，表明Hp侵入AGS细胞可以促进细胞的增殖。3.3、Hp侵袭AGS细胞对细胞凋亡的影响：经TUNEL染色法检测，ControlA和Control B的细胞凋亡率（AI）分别为3.11%，2.54%，A组和B组中幽门螺杆菌对细胞均具有诱导凋亡的作用，分别与Control A和Control B相比，细胞凋亡率AI均高于对照组， B组Hp的诱导凋亡作用（凋亡率AI在11%~31%之间）与A组（凋亡率AI在12%~34%之间）相比，无显著差异，P>0.05，表明Hp侵入AGS细胞对细胞的凋亡无影响。结论1、Hp可以侵入胃上皮细胞并在细胞内繁殖，可在细胞内存活4d。2、幽门螺杆菌的侵袭力与消化性疾病严重程度呈正相关，分离自胃癌和胃溃疡的Hp侵袭力显著高于分离自胃炎的Hp；幽门螺杆菌的侵袭力与细菌的粘附能力呈正相关。3、不同侵袭力菌株所测的基因cagA、cagE、vacA、babA、iceA以及cagA-EPIYA分型无差异，提示幽门螺杆菌的侵袭强度与这些基因无关。4、β1整合素介导和细胞内肌动蛋白聚合是Hp侵袭AGS细胞的重要途径，细胞内途径的阻断对Hp的侵袭抑制更显著。5、Hp侵入AGS细胞可以促进细胞的增殖，但对诱导细胞的凋亡无影响。