类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一个累及小关节为主的系统性自身免疫病,临床症状一般表现为慢性、对称性、进行性多关节炎。基本病理特征以滑膜细胞大量异常增生和关节腔异常狭窄,最终致使关节活动受限,关节功能受到破坏。其病因与发病机制至今仍不完全清楚,早期诊断和早期有效的治疗可预防关节损伤,取得较好的远期疗效。但在临床缺少有效的治疗药物,近年来,随着细胞免疫治疗的兴起,大量研究者将间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSCs)用于治疗类风湿关节炎进行了有益的探索。巨噬细胞是构成机体先天免疫应答的重要部分,可表达黏附分子、趋化因子受体和其他表面抗原,还分泌趋化因子、细胞因子、生长因子、蛋白酶和其他介质,通过招募其它免疫细胞、提呈抗原、促进自身免疫反应等,在RA发病过程中发挥了重要作用。巨噬细胞根据其激活途径通常分为经典激活的巨噬细胞(M1巨噬细胞)和选择性活化的巨噬细胞(M2巨噬细胞),M1巨噬细胞的特征在于增加杀微生物活性并产生促炎介质,促进CD4+淋巴细胞的Th1反应,但是M2巨噬细胞具有分泌抗炎细胞因子效应,M2巨噬细胞在抑制Th1免疫反应和增强组织重塑中起重要作用。MSCs作为骨髓来源的非造血祖细胞,其来源丰富广泛,体外环境中容易培养,具备自我分化和低免疫原性,不涉及伦理道德相关的条件限制等诸多优点。MSCs可通过与巨噬细胞直接接触或分泌可溶性因子调节巨噬细胞的功能已经在多种炎症相关疾病中研究和报道过,并具有一定的的治疗作用。人脐带来源的间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)对佐剂性关节炎大鼠是否有治疗作用以及其对大鼠巨噬细胞相关免疫功能的影响尚未清楚。目的:研究hUC-MSCs静脉注射给药对佐剂性关节炎大鼠的治疗作用,以及hUC-MSCs影响大鼠巨噬细胞功能的初步机制。方法:应用完全弗氏佐剂法建立佐剂性关节炎大鼠模型(adjuvant arthritis,AA),将模型动物随机分为模型组、hUC-MSCs(2×10~6,5×10~6cells/ml,尾静脉注射)组、益赛普组(2.8mg/kg,皮下注射),另取正常大鼠作为对照组。造模后每周记录大鼠体重、足爪容积、进行全身评分和关节炎指数评分、计算关节肿胀数;d21开始给药,给药2周后处死动物,称量胸腺、脾脏重量,计算相应指数,HE染色法观察大鼠踝关节组织和脾脏组织病理学变化;ELISA检测AA大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17的水平;CCK-8法检测T、B淋巴细胞增殖功能,中性红检测大鼠巨噬细胞的吞噬功能;流式细胞术检测T细胞和巨噬细胞相关亚群百分比。分离AA大鼠炎症高峰期腹腔巨噬细胞,体外与不同数量的hUC-MSCs共培养48小时后检测巨噬细胞极化情况、巨噬细胞吞噬功能以及共培养上清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10水平。结果:1.hUC-MSCs对AA大鼠体重的变化和关节炎指标的影响在AA大鼠注射CFA后d21给予hUC-MSCs(2×10~6,5×10~6cells/ml)组、益赛普(2.8mg/kg)治疗2周后,与模型组大鼠相比,hUC-MSCs和益赛普治疗组大鼠的足爪肿胀度、关节炎指数、全身系统性评分和关节肿胀数明显下降,体重明显增加。2.hUC-MSCs对AA大鼠踝关节病理的影响踝关节病理学检查发现,AA模型大鼠的关节结构破坏明显,滑膜细胞增生显著,炎性细胞浸润明显,同时还有新生血管和血管翳的形成;hUC-MSCs和益赛普治疗组的踝关节病理有明显的改善作用。3.hUC-MSCs对AA大鼠脾脏病理的影响组织病理学检查可见,模型组AA大鼠脾脏生发中心数量增多,淋巴细胞严重浸润,白髓与红髓之间界限模糊。与模型组相比较,hUC-MSCs和益赛普治疗组动物脾脏组织的生发中心数量减少、淋巴细胞浸润减轻,评分显著降低。4.hUC-MSCs对AA大鼠胸腺指数和脾脏指数的影响模型组大鼠的脾脏和胸腺器官的体积比正常大鼠显著肿大,两种器官的指数相应升高;hUC-MSCs组、益赛普组大鼠的脾脏和胸腺指数明显降低。5.hUC-MSCs对AA大鼠胸腺T、B淋巴细胞增殖反应的影响与正常组比较,模型组AA大鼠T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖反应强,hUC-MSCs和益赛普治疗组大鼠的T,B淋巴细胞增殖反应活性不同程度受到抑制。6.hUC-MSCs对AA大鼠脾脏CD4~+T细胞亚群比例的影响流式细胞术检测脾脏淋巴细胞比例显示,与正常组大鼠比较,AA模型组大鼠脾脏总T细胞(CD3~+)、辅助性T细胞(CD3~+CD4~+)、细胞毒性T细胞(CD3~+CD8~+)、γδT细胞(CD3~+TCR~+)和未致敏T细胞(CD4~+CD62L~+)百分比明显增加;双阴性T细胞(CD3~+CD4~-CD8~-)和记忆T细胞(CD4~+CD44~+)百分比降低。与模型大鼠相比,hUC-MSCs和益赛普治疗组大鼠双阴性T细胞(CD3~+CD4~-CD8~-)、未致敏T细胞(CD4~+CD62L~+)细胞亚群比例明显升高;总T细胞(CD3~+)、辅助性T细胞(CD3~+CD4~+)、细胞毒性T细胞(CD3~+CD8~+)、γδT细胞(CD3~+TCR~+)、记忆T细胞(CD4~+CD44~+)亚群的比例显著下降。7.hUC-MSCs对AA大鼠腹腔巨噬细胞亚群百分比的影响流式细胞术检测腹腔巨噬细胞结果显示,模型大鼠M2型巨噬细胞(CD11b~+CD163~+)和M1型巨噬细胞(CD11b~+CD86~+)均有显著性差异变化;与模型组相比,hUC-MSCs和益赛普治疗组M2型巨噬细胞(CD11b~+CD163~+)百分比显著升高;但是M1型巨噬细胞(CD11b~+CD86~+)的百分比明显下降。8.hUC-MSCs对AA大鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响大鼠巨噬细胞吞噬功能结果显示,模型大鼠巨噬细胞吞噬功能明显增强;与模型组AA大鼠相比,hUC-MSCs和益赛普治疗组大鼠巨噬细胞的吞噬功能均可不同程度受到抑制。9.hUC-MSCs对AA大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-17水平的影响ELISA检测结果显示,模型组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17均显著升高,血清中IL-10水平显著降低,hUC-MSCs和益赛普治疗组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17水平降低,血清IL-10的水平升高。10.hUC-MSCs的形态与鉴定细胞形态呈现长梭状,细胞呈现旋涡状分布排列生长。流式细胞术鉴定显示:hUC-MSCs表面的阳性标记分子CD73、CD90、CD105阳性表达率分别为99.54%、99.78%、97.21%;而细胞表面的阴性标记分子CD14、CD34、CD45、HLA-DR的阳性表达率分别为0.52%、0.07%、0.01%、0.02%。11.hUC-MSCs体外对大鼠巨噬细胞形态以及极化的影响显微镜下观察AA大鼠巨噬细胞形态多异,细胞形态呈现出伪足并呈树枝状、棒状为特点;与hUC-MSCs共培养48小时后,棒状、星状以及树枝状形态的巨噬细胞形态数量显著减少,大部分细胞呈现圆形,M2型巨噬细胞(CD11b~+CD163~+)百分比下降,M1型巨噬细胞(CD11b~+CD86~+)百分比增加;经hUC-MSCs与巨噬细胞按比例(1:1、1:5、1:10、1:50)共培养后,M2型巨噬细胞百分比增加,M1型巨噬细胞的百分比降低,其巨噬细胞百分比随hUC-MSCs的比例变化而变化,M2/M1之比随共培养hUC-MSCs数量增加而增加。12.hUC-MSCs体外对大鼠巨噬细胞的吞噬功的影响检测巨噬细胞吞噬功能结果显示,与正常大鼠巨噬细胞比较,AA模型大鼠巨噬细胞吞噬功能增强;hUC-MSCs与模型组巨噬细胞按比例(1:1、1:5、1:10、1:50)共培养巨噬细胞吞噬功能受到抑制,其抑制巨噬细胞吞噬功能的效应随hUC-MSCs的数量比例增加而增加。13.hUC-MSCs体外对大鼠巨噬细胞共培养上清中细胞因子水平的影响ELISA法测定共培养上清中TNF-α,IL-1β,IL-6和IL-10等细胞因子的变化。与正常组相比,模型大鼠细胞上清中TNF-α,IL-1β和IL-6水平明显升高,IL-10水平显著降低;hUC-MSCs与巨噬细胞按比例(1:1,1:5,1:10,1:50)共培养,共培养上清中TNF-α,IL-1β和IL-6水平明显降低,而共培养上清中IL-10水平显著升高。结论:1.尾静脉注射hUC-MSCs可以改善AA大鼠关节损伤,降低关节和脾脏病理评分,抑制AA大鼠T、B淋巴细胞增殖,调节T淋巴细胞亚群比例和细胞因子水平,对AA大鼠具有治疗作用;2.hUC-MSCs体内外可抑制AA大鼠巨噬细胞从M1型向M2型极化,抑制巨噬细胞吞噬功能,降低TNF-α、IL-1β和IL-6水平,升高IL-10水平。