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【目的】1.探讨慢性乙型肝炎(CHB)患者视黄酸(维甲酸)诱导基因蛋白1(Retinoic acid-Inducible Gene I,RIG-I)表达与IFN疗效间的关系,评价临床常用指标(HBs Ag、HBe Ag、HBV DNA)及RIG-I表达量对CHB患者IFN疗效的预测。2.探究RIG-I与IFN信号转导通路间的关系。深入研究RIG-I调控JAK-STAT信号转导通路下游抗病毒蛋白的表达情况及IFN疗效的作用机制。为临床个体化治疗CHB患者和预后分析提供理论基础。【方法】1.RIG-I定量检测作为判断CHB患者应用IFN疗效的预测价值入选对象来自于2013年1月~2014年7月于福建医科大学附属第一医院就诊,并接受规范IFN-α药物治疗的CHB患者65例,其中HBe Ag阳性患者44例,HBe Ag阴性患者21例。根据疗程结束时(48周规范治疗及24周随访)的疗效(依据HBs Ag、HBe Ag及HBV DNA载量判断)分为两组:应答组(Responders)及无应答组(No-Responders)。上述病例运用化学发光微粒子免疫分析法(CMIA)定量检测其HBs Ag、HBe Ag浓度,速率法检测ALT、AST等生化指标,运用荧光探针及实时荧光定量PCR对标本进行HBV基因分型及DNA载量检测,同时通过设计特异性引物,应用实时荧光定量PCR检测RIG-I相对表达量。比较上述临床检验指标及RIG-I对干扰素疗效的预测价值。对所得的数据采用正态性检验、成组t检验、χ2检验、ROC曲线进行统计学分析。2.RIG-I在IFN对CHB患者发挥抗病毒效应的机制研究IFN产生效应主要通过JAK-STAT信号转导通路完成的。为了研究感染HBV状态下,RIG-I与JAK-STAT信号通路及其下游抗病毒蛋白的相互关系。在体外实验中,首先在第一部分收集的标本中,通过设计特异性引物检测JAK-STAT通路下游的抗病毒蛋白表达情况(ADAR1、Mx A、OAS、PKR)。对比应答组与无应答组间抗病毒蛋白的表达差异。接着通过培养Hep G2细胞,运用针对RIG-I基因设计的si RNA,经瞬时转染Hep G2细胞,进而敲除RIG-I基因。比较敲除RIG-I基因与阴性对照组中各抗病毒蛋白的表达差异。再在细胞培养液中添加不同浓度的IFN(0 U、50 U、100 U),对比Hep G2细胞中在不同IFN浓度下,抗病毒蛋白的表达变化。最后,结合上述两因素,分析RIG-I基因在IFN信号转导通路的调控机制。【结果】1.RIG-I定量检测作为判断CHB患者应用IFN疗效的预测价值应用IFN治疗的CHB患者共65例,其中应答组30例,无应答组35例。HBe Ag阳性患者42例,其中应答组12例,无应答组30例。HBe Ag阴性患者23例,其中应答组18例,无应答组5例。经SPSS统计学分析,排除了年龄及性别对结果的影响。统计数据发现,65例CHB患者中,应答组与无应答组间HBV基因型无明显差异(P=0.523),治疗前HBs Ag、HBV DNA、ALT、AST等临床检验指标在两组间差异亦无统计学意义(P值分别为0.074、0.073、0.444、0.534)。仅RIG-I表达具有统计学意义(P=0.001)。在HBe Ag阳性患者中,应答组治疗前RIG-I表达明显高于无应答组(P值为0.014)。在HBe Ag阴性患者中,所有检测指标均无统计学意义,应答与无应答组治疗前仅RIG-I表达差异P值接近0.05(P=0.053)。通过ROC曲线比较RIG-I与临床各指标对IFN疗效的预测价值,对HBs Ag、HBVDNA及RIG-I做ROC曲线,寻求最佳预测指标。各曲线下面积(AUC)分别为0.711(RIG-I)、0.404(HBV DNA)、0.286(HBs Ag)。2.RIG-I在IFN对CHB患者发挥抗病毒效应的机制研究在CHB患者样本中检测各抗病毒蛋白表达发现,应答组PKR、ADAR1、Mx A及OAS基因表达较无应答组高,两者差异有统计学意义(p值分别为0.03、0.012、0.02、0.024)。类似的,在e抗原阳性及e抗原阴性CHB患者中,各抗病毒蛋白表达水平应答组均较无应答组高。因此,我们将PKR、ADAR1、Mx A及OAS基因作为干扰素疗效判定的指标。在Hep G2细胞敲除RIG-I基因后,发现上述抗病毒蛋白与未敲除RIG-I基因的细胞相比,表达水平显著下调,表明Hep G2细胞对病毒感染的清除能力减弱。与此同时,在Hep G2细胞培养皿中添加不同浓度的短效干扰素IFN,发现Hep G2细胞内抗病毒蛋白表达水平显著上调,上调水平与IFN浓度无关。同时还发现RIG-I的表达水平在添加IFN后也有所提高。最后,综合以上两因素(RIG-I敲除与否、IFN是否添加)观察各抗病毒蛋白的表达变化。未敲除RIG-I基因时,加用IFN后抗病毒蛋白表达水平显著升高。敲除RIG-I基因后,加用IFN与未加用IFN相比,抗病毒蛋白表达水平无明显变化。因此可以明确,CHB患者体内RIG-I蛋白在信号通路上发挥作用需要IFN的刺激,RIG-I通过上调抗病毒蛋白的表达水平,从而增强IFN的疗效。【结论】1.RIG-I定量检测作为判断CHB患者应用IFN疗效的预测价值干扰素对CHB患者的疗效与RIG-I表达有关。RIG-I表达量高,IFN疗效好;RIG-I表达量低,IFN疗效差。与传统检验指标相比,RIG-I预测CHB患者IFN疗效的特异性及敏感性均较HBs Ag及HBV DNA高,可作为新的预测CHB患者IFN疗效指标。2.RIG-I在IFN对CHB患者发挥抗病毒效应的机制研究干扰素发挥抗病毒效应主要通过JAK-STAT信号转导通路上调表达ADAR1、Mx A、PKR、OAS等抗病毒蛋白基因的表达。RIG-I正向作用于该信号通路,促进上述抗病毒蛋白的表达,从而增强IFN抗病毒的疗效。