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阿魏酸酯酶(feruloyl esterase E.C 3.1.1.73)是羧酸酯酶的一个亚类,能断开植物细胞壁中阿魏酸或其他肉桂酸与多糖之间的酯键,使得木质纤维素原料变得疏松。因而,在食品、造纸及饲料等行业有较为广阔的应用前景。阿魏酸酯酶来源菌株广泛,但原始菌株产量与工业化生产仍有很大差距。通过基因工程进行重组表达是解决上述问题的一种有效途径。本研究实现了黑曲霉(Aspergillus niger)阿魏酸酯酶在不同酵母宿主中的组成型表达,在摇瓶水平,对产酶优势重组菌株进行了发酵优化,对研究酵母组成型表达系统和阿魏酸酯酶的发酵生产具有一定的借鉴意义。主要研究内容和结果有:对A.niger阿魏酸酯酶基因序列进行了信号肽预测,以A.niger染色体DNA为模板,通过重叠延伸PCR克隆得到不含自身信号肽的A.niger阿魏酸酯酶基因(AnfaeA),长度为783 bp。构建表达载体pET28aAnfaeA转化大肠杆菌(Escherichia coli)得到重组菌株,经IPTG诱导后,目的蛋白以没有活性的包涵体形式存在。分别构建重组表达载体pKLAC1AnfaeA、pRACTHα1AnfaeA、pRACTHα2AnfaeA、pGAP9KAnfaeA、pRGCTHα1AnfaeA和pRGCTHα2AnfaeA,电转化乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis GG799)、毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),成功构建得到以下重组酵母菌株:重组K.lactis GG799:K.lactis/pKLAC1AnfaeA,K.lactis/pRACTHα1AnfaeA,K.lactis/pRACTHα2AnfaeA;重组P.pastoris GS115:P.pastoris/pGAP9KAnfaeA,P.pastoris/pRGCTHα1AnfaeA,P.pastoris/pRGCTHα2AnfaeA;重组S.cerevisiae:S.cerevisiae/pRACTHα1AnfaeA,S.cerevisiae/pRACTHα2AnfaeA。对上述重组酵母进行发酵产酶比较,其中,重组P.pastoris GS115中P.pastoris/pGAP9KAnfaeA酶活最高,发酵84 h后,上清液中酶活达5.72±0.10U?m L-1。通过单因素实验对P.pastoris/pGAP9KAnfaeA摇瓶水平进行发酵优化,并通过响应面法优化了培养基中的关键因素:葡萄糖,蛋白胨和酵母膏浓度。结果表明,最适发酵培养基为(g?L-1):葡萄糖42,蛋白胨16,酵母膏28,CaCO3 0.2;最适发酵条件为:种龄28 h,接种量3%(v/v),装液量40 m L/250 mL。在此基础上,30℃,200 r?min-1培养84 h,发酵上清中阿魏酸酯酶酶活为15.67±0.17 U?mL-1,是优化前的2.74倍。经硫酸铵沉淀(终浓度为60%)和离子交换层析(DEAE-Sepharose Fast Flow)对重组阿魏酸酯酶进行纯化,比酶活为59.75 U?mg-1,SDS-PAGE电泳显示为单一条带,大小为40 kDa。其最适反应温度为50℃,最适pH为5.0,在30~50℃以及pH 4~7范围内较为稳定。