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研究背景糖尿病是由于胰岛素分泌缺乏和(或)胰岛素作用障碍而引起慢性血葡萄糖水平升高为特征的代谢性疾病,目前由于缺乏针对病因的治疗,其治疗效果存在一定局限。因此进一步明确胰岛素分泌的机制与寻求更好的糖尿病治疗方法一直是医学研究热点。DEPTOR即包含DEP域的与哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)相互作用的蛋白,在不同的细胞中功能有所不同。在骨骼肌细胞中通过DEPTOR激活非胰岛素依赖性AKT通道,维持餐后血糖的稳态;在脑组织中,DEPTOR蛋白过表达可以激活Akt/PKB信号通路从而阻断高脂饮食诱导的小鼠肥胖症。另一方面,已有研究证实mTOR复合物是调控胰岛β细胞质量与功能的关键蛋白,DEPTOR是复合物中的共有组分,DEPTOR的丢失是否会影响胰岛β细胞的增殖及胰岛素分泌功能,目前国内外尚缺乏相关研究。研究目的利用糖尿病小鼠模型明确DEPTOR在胰岛内的表达情况,并观察是否与糖尿病存在相关性;利用RNA干扰技术(RNAi),研究体外合成的siDEPTOR分子对胰岛β细胞株NIT-1细胞DEPTOR基因沉默作用,并观察沉默DEPTOR基因对NIT-1细胞胰岛素分泌的影响及细胞增殖活力改变。研究方法引入糖尿病db/db小鼠模型,免疫组化及免疫荧光双标法明确DEPTOR蛋白在胰岛细胞内的表达情况,并比较糖尿病小鼠与正常小鼠DEPTOR蛋白的差异表达;公司设计合成一对阴性siRNA对照、一对阴性带绿色荧光膜结合蛋白(FAM)荧光对照、一对阳性对照siRNA序列及3对(siDEPTOR 385组及siDEPTOR 766 组、siDEPTOR 1275 组)针对 DEPTOR 基因的 siRNA 序列,利用脂质体法将siRNA转染至NIT-1细胞,6h后荧光显微镜下观察各组转染效率;qPCR检测转染48h后DEPTOR mRNA相对表达量;ELISA胰岛素试剂盒检测转染后48h细胞上清液胰岛素释放量;CCK8法检测转染48h后细胞增殖活力改变;Western blot检测转染48h后DEPTOR及下游相关蛋白S6、4EBP-1、AKT及其活性形式p-S6、p-4EBP-1、p-AKT的表达情况。研究结果1.DEPTOR基因与糖尿病存在相关性:免疫组化显示正常小鼠胰岛中胰岛存在DEPTOR蛋白的表达,并且糖尿病小鼠胰岛内DEPTOR蛋白表达较正常小鼠明显增多;DEPTOR/INSULIN免疫荧光双标染色进一步证实糖尿病小鼠胰岛β细胞内DEPTOR蛋白较正常小鼠明显增多;2.在荧光显微镜下观察,siRNA能有效转入到NIT-1细胞内,呈绿色点状荧光;3.QPCR检测干扰后DEPTOR mRNA的相对表达量,发现设计合成3对siRNA序列中有两对siRNA序列(siDEPTOR 385组及siDEPTOR 766组)对DEPTOR基因有干扰效果,转染后能显著抑制靶基因DEPTOR mRNA的表达,干扰效果与阴性对照差异有统计学意义;4.ELISA检测细胞胰岛素释放量,有效转染siDEPTOR 766组的胰岛素分泌量显著高于阴性对照转染组及空白转染组;5.CCK8法检测细胞增殖活力,在前60min,有效转染siDEPTOR 766组的细胞生长趋势与阴性对照组相似(有效转染组稍低于阴性对照组,无统计学意义),随着时间延迟(90min-120min),有效转染siDEPTOR766组细胞的增殖活力显著高于阴性对照组及空白转染组;6.Western-blot检测结果,有效RNA干扰组p-S6及p-4EBP-1蛋白的表达量较阴性对照转染组均显著增多,p-AKT蛋白的表达量较阴性对照转染组稍有下降。研究结论本实验发现糖尿病小鼠胰岛β细胞内DEPTOR蛋白较正常小鼠明显增多,证明了 DEPTOR基因与糖尿病存在相关性;并利用RNAi技术在NIT-1细胞上有效地沉默DEPTOR基因的表达,促进了细胞增殖和胰岛素的分泌,并验证该现象与mTORCl信号通路的激活有关。