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研究背景:动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是一种由动脉血管内脂质积聚引起的慢性炎症性疾病,巨噬细胞是参与其进展的主要免疫细胞。巨噬细胞通过清道夫受体摄取氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL）,胆固醇酯化反应将ox-LDL转化为游离胆固醇（Free Cholesterol,FC）,胆固醇外排反应将FC排出。当巨噬细胞内脂质代谢紊乱时,过多的脂质堆积在细胞内并形成大量脂滴,导致巨噬细胞转化为泡沫细胞。泡沫细胞聚集及大量死亡促进斑块形成,是疾病进展的关键因素。细胞焦亡是一种由炎症小体诱发的促炎性细胞程序性死亡方式。研究发现,在巨噬细胞中,ox-LDL可激活核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白3（Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3）炎症小体及其下游焦亡通路,诱导巨噬细胞焦亡。在AS的早期,主动脉中巨噬细胞焦亡可能进一步促进巨噬细胞源性泡沫细胞的形成,进而促进粥样硬化斑块的形成。随着疾病的进展,在AS晚期巨噬细胞焦亡可能加速坏死核心形成并引起斑块失稳。丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶7（Mitogen-activated protein kinase phosphatases 7,MKP7）属于MKP家族,在巨噬细胞、树突状细胞和T细胞的增殖、分化及细胞因子反应中发挥着重要的调节作用。近期研究报道内皮细胞中MKP7过表达可促进AS进展。然而,巨噬细胞中的MKP7在AS疾病过程中的作用未见报道。实验目的:在小鼠巨噬细胞RAW264.7和小鼠原代腹腔巨噬细胞中上调或抑制MKP7表达,探究MKP7在巨噬细胞泡沫化和焦亡中的作用。实验方法:1、为了确定ox-LDL处理RAW264.7细胞的最佳浓度,本实验采用不同浓度（0、25、50、75、100μg/m L）ox-LDL处理RAW264.7细胞24 h,用CCK8法检测RAW264.7细胞生存活力,并用Western Blot法检测细胞内MKP7蛋白的表达情况;选取MKP7蛋白表达最高时ox-LDL的浓度处理RAW264.7细胞不同时间（12、24、48 h）,Western Blot法检测细胞内MKP7蛋白的表达,以确定处理时间。2、用pRM02和pRM02-MKP7质粒分别转染RAW264.7细胞,构建MKP7稳定过表达巨噬细胞系（RAW-MKP7,对照细胞为RAW-PR）;或用抑制MKP7表达的慢病毒（Lenti-sh MKP7,其对照病毒为Lenti-SC）感染RAW264.7细胞24 h,加入ox-LDL诱导巨噬细胞24 h,使用油红O染色法观测细胞内脂滴含量;采用总胆固醇（TC）、游离胆固醇（FC）检测试剂盒分析细胞内TC、FC、胆固醇酯（CE）浓度,从而评估细胞内脂质代谢情况;并通过q PCR法检测胆固醇酯化反应关键酶ACAT1、水解反应关键酶n CEH、胆固醇外排转运蛋白ABCA1和ABCG1以及清道夫受体CD36、SR-AI、LOX-1的转录表达水平,Western Blot法检测清道夫受体CD36、SR-AI、SR-B1蛋白表达;抑制MKP7表达时,使用Dil-ox-LDL检测巨噬细胞吞噬功能变化,以分析MKP7在ox-LDL诱导的巨噬细胞泡沫化过程中的调节作用;使用Transwell法检测巨噬细胞的迁移能力。同时用Lenti-SC和Lenti-sh MKP7分别感染小鼠原代腹腔巨噬细胞,用ox-LDL处理24 h,采用Western Blot法检测CD36、SR-AI表达情况;使用Dil-ox-LDL处理检测细胞吞噬功能变化。3、在过表达（感染表达MKP7逆转录病毒Retro-MKP7,其对照病毒为Retro-PLN）或抑制表达（感染Lenti-SC和Lenti-sh MKP7慢病毒）MKP7的小鼠原代腹腔巨噬细胞中,用ox-LDL诱导24 h后,采用LDH检测试剂盒检测LDH的释放;使用ROS检测试剂盒检测细胞内ROS生成变化;通过Western Blot法检测焦亡通路相关蛋白表达及活化水平。结果与分析:1、ox-LDL抑制RAW264.7细胞活力并调节MKP7表达CCK8结果显示,与对照组相比,各处理组中细胞的存活能力均显著降低（P<0.01）。同时Western Blot结果显示,MKP7的表达量随着ox-LDL浓度升高而增加,在50μg/m L ox-LDL处理时达到顶峰,随后下降;用50μg/m L ox-LDL处理RAW264.7细胞不同时间后,发现在24 h时MKP7的表达最高。基于以上结果,我们选取50μg/m L ox-LDL诱导巨噬细胞24 h进行后续实验。2、MKP7促进巨噬细胞源性泡沫细胞形成油红O染色结果显示,ox-LDL诱导RAW264.7细胞后细胞内脂滴含量明显增加（P<0.01）,抑制MKP7表达可减少ox-LDL诱导的脂质沉积,而MKP7过表达可进一步促进ox-LDL诱导的细胞内脂质沉积。细胞内TC、FC、CE含量检测显示干扰MKP7表达则抑制了ox-LDL诱导的细胞内TC、CE浓度增加（P<0.01）和FC浓度降低（P<0.01）,而MKP7过表达进一步促进ox-LDL诱导的TC、CE、FC浓度变化。随后,我们在分子水平上探究MKP7在泡沫细胞脂质沉积中的作用。q PCR结果显示,ox-LDL处理组中胆固醇酯化反应关键酶ACAT1的m RNA表达显著增加（P<0.01）,胆固醇水解关键酶n CEH、胆固醇外流转运蛋白ABCA1和ABCG1的m RNA表达明显下降（P<0.05）,干扰MKP7表达则抑制了上述分子的表达变化（P<0.05）,过表达MKP7则进一步促进了ACAT1表达上调（P<0.05）,n CEH、ABCA1和ABCG1表达降低（P<0.01）。以上结果表明MKP7可能通过调节巨噬细胞内胆固醇酯化、水解和外排参与泡沫细胞形成。接下来,我们进一步探究了MKP7是否参与巨噬细胞摄取ox-LDL的过程。q PCR结果显示,ox-LDL诱导组中清道夫受体CD36、SR-AI、LOX-1的m RNA表达显著上调（P<0.05）,干扰MKP7表达则抑制了上述分子的表达变化（P<0.05）,MKP7过表达进一步促进了清道夫受体表达增加（P<0.05）。Western Blot结果显示抑制MKP7表达后清道夫受体CD36、SR-AI、SR-B1蛋白表达显著降低（P<0.05）,而MKP7过表达时则进一步促进了ox-LDL诱导的清道夫受体表达增加（P<0.05）。巨噬细胞亦可通过吞噬作用摄取ox-LDL,随后我们检测巨噬细胞吞噬功能变化。采用50μg/m L Dil-ox-LDL处理RAW264.7细胞6 h后结果显示,与对照组相比,Dil-ox-LDL处理组中红色荧光细胞数明显增加,干扰MKP7表达后其数量显著降低。Transwell结果显示,ox-LDL处理RAW264.7细胞后,其迁移能力减弱,抑制MKP7表达则改善了ox-LDL诱导的巨噬细胞迁移能力减弱,而MKP7过表达后巨噬细胞迁移能力进一步减弱。本实验在小鼠原代腹腔巨噬细胞中沉默MKP7表达后检测CD36、SR-AI蛋白表达和Dil-ox-LDL摄取情况,结果与RAW264.7细胞中结果一致。3、MKP7促进原代巨噬细胞焦亡LDH活性检测结果显示,ox-LDL诱导组细胞的LDH释放量显著增加（P<0.01）,干扰MKP7表达显著抑制细胞释放LDH（P<0.01）,而MKP7过表达则进一步促进了LDH的释放（P<0.01）。ROS结果显示,ox-LDL处理组原代腹腔巨噬细胞内ROS生成显著升高（P<0.01）,抑制MKP7表达后细胞内ROS水平显著降低（P<0.01）,而MKP7过表达则进一步促进ox-LDL诱导的ROS生成增加（P<0.01）。本实验进一步在分子水平上探究MKP7在原代巨噬细胞焦亡中的作用。结果显示,与对照组相比,ox-LDL处理组中NLRP3、ASC、Caspase1剪切体、IL-1β成熟体和GSDMD剪切体的表达显著上调（P<0.05）,抑制MKP7表达后,ox-LDL诱导组中NLRP3、ASC、Caspase1剪切体、IL-1β成熟体和GSDMD剪切体的表达水平急剧下降（P<0.05）。而MKP7过表达后NLRP3介导的炎症小体及其下游的焦亡通路的活化进一步被促进（P<0.05）,表明MKP7促进巨噬细胞焦亡。结论:1、MKP7可通过促进清道夫受体表达、胆固醇酯化、巨噬细胞迁移能力减弱和抑制胆固醇水解、胆固醇外流,进而促进巨噬细胞泡沫化。2、MKP7可促进ox-LDL诱导的巨噬细胞焦亡。