Survivin在急性髓系白血病中的表达及AML1a对小鼠造血干祖细胞的调节作用及其在白血病中的致病作用研究

来源 :北京协和医学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:yongjianok
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研究目的:检测Survivin及BCL2家族成员BCL-2、Bcl-xL和MCL-1在急性髓系白血病患者骨髓标本中的表达情况。探讨Survivin在急性髓系白血病中的可能作用、表达特点、预后意义及其与BCL-2、Bcl-xL和MCL-1表达之间的相关性。研究方法:应用免疫组织化学染色方法检测Survivin、BCL-2、Bcl-xL和MCL-1蛋白在63例初诊急性髓系白血病患者骨髓中的表达差异。比较Survivin表达量与正常对照的差别,并分析其与年龄、性别、白细胞计数、诊断分型、预后分型以及治疗疗效等临床参数之间关系,特别是与FLT3-ITD突变和AML1/ETO融合蛋白之间的联系;描绘患者的生存曲线,分析Survivin的预后意义及有效的治疗方案;分析Survivin表达与BCL-2、Bcl-xL和MCL-1表达之间的相关性。结果:1.AML患者骨髓中Survivin的中位表达率为9.8%,高于对照组(p=0.01);Survivin阳性患者比例为44.4%,而对照组为0%,二者有明显的统计学差异(p=0.011)。综上,Survivin在AML中的表达水平增高。2. Survivin表达量与患者的年龄、性别、白细胞计数、血红蛋白水平、外周血及骨髓原始细胞计数等临床变量无关;Survivin与患者是否有皮肤苍白、发热、出血倾向、淋巴结肿大以及肝脾大等临床症状和体征之间无明显相关性(p>0.05),但Survivin阳性提示可能会发生严重感染(p=0.005)。Survivin在不同NCCN预后分组以及FAB诊断分型中表达量无显著差异(p>0.05)。Survivin阳性患者其CR率低于阴性患者而复发率高于阴性患者,但无统计学差异(p>0.05)。3. AML1/ETO阳性AML患者中Survivin阳性者11例(39.3%),中位表达率为23.7%;阴性患者18例(51.4%),中位表达率为1%,表达水平与其他类型并无明显差异(p=0.243)。Survivin阳性患者在FLT3-ITD阳性患者中所占的比例为44.4%,低于在FLT3-ITD阴性患者中所占比例(55.6%),且FLT3-ITD阳性患者的中位表达率(2%)低于FLT3-ITD阴性患者(5%),经卡方检验和秩和检验均未发现两种差异有统计学意义(p=0.525)。c-Kit、NPMl以及CEBPA突变与Survivin的表达无相关性。4. Survivin阳性组患者累积生存率低于Survivin阴性组患者(p=0.04);Survivin阳性患者中表达率位于中位表达率(23.35%)以上的患者生存率明显高于表达率位于中位表达率以下的患者(p=0.035)。Survivin阳性患者在联合化疗中,中剂量HAD+DA方案组生存率高于标准剂量HAD+HD-A方案(p=0.049)。最终接受造血干细胞移植治疗的Survivin阳性患者生存率高于单纯接受化学治疗者(p=0.048)。5. Survivin表达水平与MCL-1呈明显正相关(r=0.639,p=0.000),而与BCL-2(r=0.143,p=0.105)和Bcl-xL(r=0.028,p=0.756)无明显相关性。结论:1. Survivin在急性髓系白血病患者骨髓中高表达,提示其与AML发生、发展密切相关。2. Survivin可作为AML患者预后不良的参考指标。3. Survivin阳性患者较优治疗方案是造血干细胞移植;较优化疗方案为中剂量HAD+DA方案。4. Survivin表达与AML1/ETO及FLT3-ITD突变均无相关,与MCL-1有可能的相互作用或协同作用。AML1也称之为PEBP2αB、CBFa2或RUNX1,是一种重要的转录调节因子,其通过选择性剪接产生至少三种异构体:AMLla、AML1b和AMLlC。与AML1b和AML1c不同,AML1a具有DNA结合结构域,但缺少转录激活结构域,因此通常被认为不具有转录激活功能,但由于其具有DNA结合结构域,可以与AML1b/1c竞争结合靶基因的DNA结合位点,导致靶基因不能正常转录,提示AML1a可能干扰AML1的转录调节功能,这与AML1/ETO融合蛋白的作用机制是类似的。AML1/ETO可诱发急性髓系白血病,但是我们前期实验已证实在致死剂量照射的小鼠体内转导入AML1a,最终小鼠发生了T淋巴细胞白血病。此过程中是否照射改变了小鼠的骨髓微环境,导致整合入AML1a的小鼠造血干细胞向淋系转化,还是AML1a本身对淋巴细胞的分化有影响不得而知。AML1a是否对小鼠造血干祖细胞具有调节作用也不清楚。为了进一步研究AML1a在造血及白血病发病中的作用并探讨其作用机制,本文完成了下列研究工作:1. AML1a表达载体的构建及病毒的制备pMSCV-FLAG-AML1a-IRES-GFP质粒和pMSCV-IRES-GFP分别与辅助质粒pV Pack-Eco(含Env)通过磷酸钙沉淀法转染293T细胞,制备逆转录病毒。病毒感染3T3细胞,检测病毒滴度,并测定AML1a的表达情况。结果显示在感染的细胞中证实有AML1a和GFP的表达,所制备的病毒滴度满足后续实验的要求。2. AML1a在小鼠造血细胞增殖分化中的作用及在白血病中的致病作用1)将逆转录病毒转导AML1a的C57小鼠的骨髓单个核细胞,尾静脉注射至致死剂量照射或不照射的B6雌性小鼠体内,单一转导GFP空载体的致死剂量照射或不照射小鼠作为对照。定期尾静脉取血,查血象及外周血GFP阳性率,发现致死剂量照射后转导AML1a的小鼠外周血GFP荧光阳性率随时间逐渐升高,达到峰值后又逐渐下降;致死剂量照射后转导入空载体的小鼠则逐渐降低;未照射转导AML1a及空载体的小鼠外周血GFP荧光阳性率则始终为O。2)致死剂量照射小鼠转导AML1a及空载体后12个月,取其骨髓细胞,流式细胞仪分析其长期造血干细胞(LT-HSC)、短期造血干细胞(ST-HSC)、多能祖细胞(MPP)、共同髓系祖细胞(CMP)、粒单核系髓系祖细胞(GMP)以及红系巨核系祖细胞(MEP)等的变化和不同,结果显示:与致死剂量照射后仅转导GFP的小鼠相比,致死剂量照射后转导AMLla的小鼠整个干祖细胞群数量明显增加,尤其LSK(包括LT-HSC、ST-HSC.MPP)细胞增加更为显著;LSK中LT-HSC的比例增加了18.7%,ST-HSC增加61.9%,而MPP则减少了56.7%。综上所述,本研究通过逆转录病毒转导AML1a至小鼠BMMNC中,并将其移植到致死剂量照射或不照射的小鼠体内,其造血系统发生一系列变化,提示AML1a能够促进造血干细胞的自我更新,提高增殖能力,但不足以引起造血细胞恶性转化并导致白血病发生,尚需要某种二次打击。
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