毛竹反转录转座子分子标记SSAP的开发与利用

来源 :浙江农林大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:ericc0123
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毛竹(Phyllostachys edulis)分布广,种植面积大,是我国重要的非木材森林资源。反转录转座子在植物基因组中含量丰富,能够调控基因表达,改变基因组大小,是引起毛竹基因组多样性的一个重要因素。本文开发了5个SSAP(Sequence specific amplified polymorphism)分子标记,并将其应用于毛竹种下变型及毛竹实生苗的遗传多样性分析,为毛竹种质资源开发与利用提供可靠技术和理论依据。1、利用LTRharvest软件在毛竹基因组中鉴定出7 731个具有完整LTR序列的LTR反转录转座子,从中筛选出LTR序列相似性≥90%、拷贝数≥15且结构域完整的35个cluster,选取代表性序列5’LTR设计引物。选用野生型毛竹和龟甲竹(Ph.edulis(Carr.)H.de Lehaie‘Kikko-chiku’)基因组DNA检测引物位点扩增多态性和稳定性,通过测序确认,最终获得5对SSAP分子标记引物。2、将5个SSAP分子标记应用于野生型毛竹及其15个变型的遗传多样性分析。共扩增出83个多态性位点,平均多态位点比率为98.81%,多态性高于其他DNA分子标记。3、选取其中多态性较高(PIC>0.3)的3个SSAP分子标记(hic19G、hic26G和hic34G),分析毛竹实生苗材料遗传多样性。(1)野生型毛竹半同胞实生苗的平均多态位点比率为96.67%,平均多态信息量(PIC)为0.37,Nei’s指数(H)为0.251 6,Shannon’s指数(I)为0.399 7。龟甲竹半同胞实生苗平均多态位点比率为93.02%,PIC为0.45,Nei’s遗传多样性为0.173 7,Shannon信息指数为0.267 5。经统计检验,野生型毛竹半同胞实生苗群体遗传多样性显著高于龟甲竹半同胞实生苗(P<0.05),同时AMOVA方差分析显示多态性主要来源于种内变异(79%)(2)杂合毛竹实生苗平均多态位点比率为100%,平均多态信息量(PIC)为0.41,Nei’s指数(H)为0.275 2,Shannon’s指数(I)为0.430 6。经统计检验,杂合毛竹实生苗群体遗传多样性显著高于野生型毛竹半同胞实生苗(P<0.05),AMOVA方差分析表明多态性主要来源于种内变异(81%)。4、利用hic19G、hic26G和hic34G这3个SSAP分子标记分析未开花毛竹与开花毛竹的遗传多样性,发现两个群体的平均多态位点比率(87.27%和87.93%),平均PIC(0.46和0.44),平均Nei’s遗传多样性(0.225 4和0.234 4)及平均Shannon信息指数(0.348 1和0.365 8)都比较接近。经统计检验,证实两个群体间差异不显著(P<0.5)。5、PHRE1是本课题组鉴定的具有转座活性的毛竹反转录转座子,本研究利用SSAP技术分析了PHRE1转基因拟南芥的插入位点多态性,结果表明,在热胁迫(42℃)处理的转基因拟南芥基因组DNA中鉴定出多态性条带,测序发现PHRE1在拟南芥中发生了转座,说明SSAP技术也可以应用于检测反转录转座子的活动。利用hic19G、hic26G和hic34G这3个SSAP分子标记分析冷和热胁迫处理和未处理野生型毛竹半同胞实生苗遗传多样性,结果表明冷胁迫处理和未处理的野生型毛竹半同胞实生苗平均多态位点比率分别为98.33%和95.83%;热胁迫处理和未处理的野生型毛竹半同胞实生苗平均多态位点比率分别为98.48%和96.23%。经统计检验,胁迫处理和未处理两个群体间差异显著(P<0.01),冷和热胁迫处理后,半同胞毛竹实生苗的多态性增加,这可能是冷和热胁迫激活了竹子中的LTR反转录转座子,引起多态性增加。综上所述,本研究共开发了5个稳定高效的SSAP分子标记,分别应用于毛竹变型、半同胞实生苗、杂合实生苗、开花毛竹、未开花毛竹以及冷和热胁迫处理毛竹实生苗的遗传多态性分析,结果表明SSAP分子标记可以灵敏区分毛竹种下水平遗传多样性,高于传统的DNA分子标记。SSAP分子标记多样性统计结果也表明杂合毛竹实生苗相比较半同胞实生苗具有更高的遗传多样性,开花毛竹与未开花毛竹的遗传多样性没有显著差异,冷和热胁迫处理后毛竹实生苗的遗传多态性有所增加,可能是由于SSAP是基于LTR反转录转座子插入位点开发的DNA分子标记,毛竹中LTR反转录转座子如果发生转座,就会引起多态性增加,所以SSAP技术也可以应用于检测反转录转座子的活动。
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