细胞黏附分子nectin-4和nectin-2的表达、纯化及晶体筛选

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Nectin蛋白家族是一类属于免疫球蛋白超家族(immuno globulin superfamily, Ig-SF)的新型细胞黏附分子(CAMs),能够不依赖Ca2+参于细胞间的相互作用。Nectin蛋白家族共有4个成员,分别是nectin-1、nectin-2、nectin-3和nectin-4。其中nectin-4蛋白能够帮助麻疹病毒入侵人体,并且协同麻疹病毒在人的呼吸道上皮细胞中扩散转移;有相关研究表明,麻疹病毒具溶瘤作用,能够杀伤癌细胞,nectin-4蛋白在肺癌细胞、乳腺癌细胞和卵巢癌细胞中有较高的表达量,因此研究nectin-4蛋白对于麻疹病毒的防治和相关药物研发以及利用nectin-4蛋白提高癌症的诊断治疗效率有着重要的作用,nectin-2蛋白同样可以作为病毒的受体,其V结构域的结构已经解析,是一个天然二聚体,推测其发挥生物学作用依赖于形成天然二聚体,为验证这一推测,本实验表达了nectin-2V FAMP突变体蛋白,希望得到单体蛋白并结晶。本实验通过大肠杆菌外源蛋白表达系统表达蛋白,通过座滴气相扩散法、悬滴气相扩散法筛选蛋白晶体的生长条件,为nectin-4V结构域蛋白和nectin-2V FAMP突变体蛋白的结构解析提供理论依据。主要的研究结果有:(1)利用分子生物学手段成功构建nectin-4V-pET21a(+)重组质粒。(2)利用大肠杆菌外源蛋白表达系统表达出nectin-4V结构域重组蛋白(32-145),经过Ni-NTA亲和层析以及分子排阻层析纯化后,得到了高纯度的nectin-4V结构域重组蛋白。(3)利用座滴气相扩散法筛选蛋白晶体的生长条件,得到nectin-4V晶体。初筛晶体生长条件为5%v/v Tacsimate,0.1M HEPES pH7.0,10%w/v Polyethylene glycol monomethyl ether5,000,18℃。经过X-射线衍射后,得到了一套分辨率为1.8A的晶体衍射数据。分析后的数据显示晶体属于P21空间群,晶胞参数为a=33.1A,b=51.7A,c=56.9A,β=94.7°。(4)通过包涵体复性的手段,成功复性出nectin-2V FAMP突变体蛋白,经过分子排阻层析纯化后,得到了高纯度的nectin-2V FAMP突变体蛋白。(5)利用悬滴气相扩散法筛选蛋白晶体的生长条件,得到nectin-2V FAMP晶体。初筛晶体生长条件为0.1M Tris hydrochloride PH8.5,2.0M Ammonium Sulfate,18℃。经过X-射线衍射后,得到了一套分辨率为1.8A的晶体衍射数据。分析后的数据显示晶体属于P212121空间群,晶胞参数为a-43.3A, b=45.8A, c=52.6A, β=90.0°并成功解析其结构。
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