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脂肪酶具有底物范围广、立体选择性专一等优点,在制备手性药物和农用化学品中间体中发挥越来越重要的作用。(S)-2-氯丙酸乙酯和(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯是合成芳氧苯氧丙酸酯类除草剂的关键手性中间体。工业上主要多采用化学法制备,反应条件苛刻、效率低、产品纯度不高,微生物酶法催化反应条件温和,专一性强、对环境污染小,可获得较高光学纯度的手性中间体,因此研究酶法制备两种手性中间体路线的具有较高的现实意义。论文首先建立了一种产立体水解酶菌株的筛选模型。该方法基于唯一碳源富集法初筛,旋光测定和气相色谱分析复筛的两轮筛选模式。从各地采集的富油土样和实验室保藏的产酶菌株中筛选获得40株具有立体选择性水解活性的产酶菌株,其中27株产(S)-型水解酶菌株,13株产(R)-型水解酶菌株。利用形态学观察及16S rDNA基因序列分析对其中一株高立体选择性(R)-型水解酶菌株进行鉴定,确定其为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus),并命名为Bacillus pumilus WZ015。通过单因素与响应面设计实验对B.pumilusWZ015菌株的发酵培养基组份及发酵产酶条件进行了优化,确定该菌株较佳的培养基组份(g/L)：葡萄糖8.7,酵母膏9,KH2PO40.78, MgSO40.5,橄榄油3.8；菌体最佳培养条件：发酵液初始pH7.0,接种量为6%、250mL摇瓶装液量为50mL、恒温摇床发酵温度为30℃、转速为200rpm。在上述优化后的条件下,菌株B.pumilusWZ015培养22h后水解酶活力达到960U/L,为优化前的1.6倍。论文还考察了B.pumilus WZ015水解酶酶动力学拆分(R,S)-2-氯丙酸乙酯反应条件。实验结果表明B.pumilus WZ015水解酶在pH7.3的0.25mol/L磷酸钠缓冲液体系中,底物浓度为156mmol/L (2%(v/v)),菌悬液浓度0.02g/mL,反应温度35℃、恒温水浴槽转速200rpm条件下,反应150min可获得最高e.e.s值97.6%,反应转化率68.5%,E值为10.3,对反应液剩余底物构型分析确定其为(S)-2-氯丙酸乙酯。论文建立了化学-酶法制备APP类除草剂关键中间体(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯的合成路线。首先以(R,S)-2-氯丙酸乙酯、对苯二酚为起始原料化学合成消旋体2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯,产率72%,纯度90%。实验建立了手性液相分析(R,S)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯的方法,从获得的产酶菌株和实验室保藏的菌株中筛选获得3株具有立体选择性水解酶活性的产酶菌株。实验选择其中一株米曲霉WZ007(Aspergillus oryzae WZ007)菌,对其拆分(R,S)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯反应条件进行优化研究。结果表明米曲霉WZ007酶在0.20mol/L,pH为7.5磷酸钠缓冲液,酶量控制在0.67%(3mL体系添加0.02g),催化底物浓度为35mmol/L,200rpm、温度40℃恒温水浴槽条件下反应60min,可获得最高e.e.s值98.7%,转化率51.8%,E值为117,对其反应液剩余底物的构型旋光值和手性液相分析确认其为(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯且光学纯度较高。该化学-酶法制备(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯的路线为国内首创且基本达到国外研究水平,同时简化了操作步骤,因此具有一定的工业化应用前景。