目的:自然杀伤细胞（Natural Killer cells,NK）是构成机体天然免疫系统的重要成员,发挥着强大的抗肿瘤及抗感染作用,它不仅能直接通过穿孔素及颗粒酶清除靶细胞,NK细胞还可分泌大量炎性因子及免疫调节因子发挥作用,招募其他免疫细胞参与抗病毒免疫。此外,NK细胞亦可诱导感染细胞发生凋亡。随着国际老龄化的加速,老年人免疫细胞功能将受到更多的关注。同时,各种慢性感染也会导致机体免疫细胞的衰老。获得性免疫缺陷综合征（Acquired Immunodeficiency Syndrome,AIDS）是影响人类健康的重要传染病之一,HIV（Human Immunodeficiency Virus,HIV）把人体免疫系统作为主要攻击目标,大量破坏体内CD4+T淋巴细胞,可导致机体出现不同程度的免疫功能缺陷,如果不及时接受抗逆转录病毒治疗（Antiretroviral Therapy,ART）,感染者在AIDS晚期易患各种恶性肿瘤和重症感染,最终导致感染者死亡。由于ART有效延长了HIV感染者的寿命,老龄HIV感染者人数增多,然而在机体免疫系统自然衰老和HIV感染的双重影响下,感染者的健康面临着严峻的挑战。代谢为NK细胞提供生命活动所需的能量,对细胞发挥其正常功能起到至关重要的作用,代谢和细胞衰老之间是相互影响的,代谢失衡会促进细胞衰老进程,而衰老的细胞则破坏组织的代谢稳态,形成恶性循环,从而导致各种疾病的发生。但是老龄HIV感染者NK细胞代谢状态如何、HIV感染对NK细胞衰老调控的作用、以及采取怎样的代谢干预措施延缓感染者NK衰老状态等研究均尚未见报道。本文首次研究了老龄HIV感染者NK细胞代谢特征的变化,（论文一）;进一步研究了HIV感染对NK细胞衰老状态的影响及代谢对细胞衰老的调控作用（论文二）;最后探讨了延缓HIV感染者NK细胞衰老进程的干预措施及相关机制（论文三）,为HIV感染的免疫治疗提供了新的思路。研究方法:1.研究对象本研究纳入HIV感染者共计328例,其中20例为未治疗HIV感染者,308例为接受ART治疗的HIV感染者。本研究纳入的未治疗HIV感染者是HIV抗体阳性且未接受ART治疗的患者;纳入的ART治疗者是接受至少2年ART治疗且病毒载量低于检测线的患者。本研究纳入211例HIV阴性的健康对照者,健康对照者是HIV抗体阴性的健康人,且血常规检查结果正常、无免疫系统疾病、无肿瘤和无肝肾功能异常。所有受试者的年龄及性别均相匹配,以上所有受试者均签署了知情同意书,本研究通过了中国医科大学附属第一医院伦理委员会批准。2.外周血单个核细胞（PBMCs）的提取利用密度梯度离心法提取受试者外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）。3.NK细胞的分选提取受试者PBMCs后,将细胞用分选Buffer（含有2%FBS和1m M EDTA的PBS溶液）重悬至浓度为50 million/m L,根据NK细胞负选试剂盒（Easy Sep（?）Human NK Cell Isolation Kit）说明书分选NK细胞。4.多色流式细胞术检测营养物质转运体的表达水平使用Ultra Comp e Beads TM Compensation Beads调节流式细胞仪补偿。采集受试者新鲜外周血并提取PBMCs,用PBS将流式管中细胞悬液浓度调整为1 Million/m L,体积约为100μL,先封闭,再依次加入流式抗体对细胞进行染色。5.流式细胞术检测NK细胞葡萄糖摄取能力（2-NBDG）提取实验对象PBMCs,用1m L无糖培养基重悬细胞于流式管中,加入3.4μL2-NBDG（工作浓度为100μM）,充分混匀,37°C 5%CO2培养箱中孵育30分钟后;每管加入2 m L PBS,350 g,离心5分钟,弃上清,重复两遍;洗净后进行NK细胞表面染色。6.流式检测NK细胞线粒体相关标记物提取受试者PBMCs,用1 m L PBS重悬细胞于流式管中,使用Mito Tracker TM Green FM和Mito Tracker TM Orange CMTMRos试剂分别对NK细胞线粒体质量和线粒体膜电位进行检测。洗净后再进行NK细胞表面染色。7.细胞能量代谢仪检测NK细胞糖酵解和线粒体压力采集研究对象外周血,分选NK细胞,用IL-12（10 ng/m L）、IL-15（50 ng/m L）和IL-18（100 ng/m L）细胞因子混合物刺激NK细胞48小时,根据安捷伦Seahorse XF糖酵解压力测试试剂盒用户指南、细胞线粒体压力测试试剂盒标准化说明书检测NK细胞糖酵解能力和线粒体能力。实验当天用细胞粘附剂cell-tak将NK细胞接种在细胞板,每孔细胞数为0.5 Million,取出探针板加药,药物配置完成后上机进行探针板校正,运行Glycoysis Stress Test或Cell Mito Stress Test程序。8.流式检测NK细胞胞内细胞因子分泌采集研究对象外周血,提取PBMCs,计数细胞后,将细胞接种到96孔U底板,刺激NK细胞,37°C 5%CO2培养箱孵育18小时后,每孔加入1μL Golgistop,继续培养6小时,用PBS重悬细胞至1 m L体积。依次进行细胞死活、NK细胞表面、破膜和胞内染色。9.流式检测NK细胞多种免疫调控受体表达采集受试者新鲜外周血并提取PBMCs,用PBS将流式管中细胞悬液浓度调整为1 Million/m L,封闭后依次加入流式抗体对细胞进行染色。10.流式检测不同代谢途径抑制剂对HIV感染者NK细胞功能的影响采集研究对象外周血,提取PBMCs,将细胞接种到96孔U底板,每个样本分12孔,依次加入不同代谢抑制剂,除1)未刺激组外,其余11组均用细胞因子混合物刺激NK细胞过夜,第二天进行破膜染色。11.血浆细胞因子谱检测采集研究对象外周血,离心分离200μL血浆-80°C冻存。提前一天将血浆放置4°C过夜融化,实验当天,血浆样本进行3000 g离心5分钟,以去除沉淀杂质。用Bio-Plex Pro TM Human Cytokine Screening Panel,48-Plex试剂盒,进行48种细胞因子筛查。处理完毕后送入BIO-PLEX 200进行读值。12.流式检测β-半乳糖苷酶活性采集研究对象外周血,提取PBMCs,根据Senescence Assay试剂盒说明书对NK细胞β-半乳糖苷酶活性进行测定。13.流式检测NK细胞衰老标志物采集受试者外周血,提取PBMCs,先进行细胞死活染色,再对细胞进行NK细胞分群表面染色。利用BD Phosflow TM Fix Buffer I和BD Phosflow TM Perm Buffer III处理细胞后进行磷酸化染色。14.流式检测线粒体ROS采集研究对象外周血,提取PBMCs。使用Cell ROXTM Deep red Flow Cytometry Assay Kit对PBMCs进行染色,37°C孵育30分钟,用PBS洗涤细胞3遍以去除多余染料。标记后的细胞再进行NK细胞分群的表面染色,上机检测。15.HIV病毒载量测定采集受试者全血,通过离心分离出血浆,利用COBAS AMPLICOR自动载量分析仪测定HIV病毒载量。16.CD4+T细胞绝对值计数使用含EDTA的采血管采集受试者外周静脉血,向绝对计数管中分别加入20μL CD3/CD4/CD8 Tri TEST试剂及50μL抗凝全血,室温避光孵育15分钟后,向管中加入450μL免洗溶血素,室温条件下继续孵育15分钟。使用BD公司的Calibur流式细胞仪进行检测,最终用Multi SET软件进行自动分析,得出CD4+T淋巴细胞绝对值。17.流式检测HIV Gag、Env蛋白对NK细胞衰老影响采集健康人群外周血,提取PBMCs,将细胞接种到96孔U底板,用PROSPEC公司的HIV-1 Envelope和HIV-1 gag蛋白分别刺激细胞,同时用未刺激的细胞作阴性对照。18.流式检测阻断代谢通路对HIV感染者NK细胞衰老水平的影响采集研究对象外周血,提取PBMCs,计数细胞后,将细胞接种到96孔U底板,依次加入不同代谢途径抑制剂,每组均用细胞因子混合物刺激NK细胞。37°C 5%CO2培养箱孵育24小时,进行细胞衰老指标染色。19.流式检测二甲双胍对NK细胞凋亡水平影响采集研究对象外周血,提取PBMCs。将细胞接种到96孔U底板,刺激48小时后,进行NK细胞表面染色,再加入Annexin V Binding Buffer重悬细胞进行凋亡染色。20.流式检测二甲双胍对NK细胞增殖和存活能力的影响采集研究对象外周血,提取PBMCs,计数细胞后,用PBS重悬1Million细胞至1 m L体积。依次进行细胞死活染色、NK细胞表面分群染色、破核和核内因子染色。21.转录组分析采集受试者外周血,提取PBMCs,负选NK细胞,二甲双胍处理实验组后,收集细胞转录组测序,根据基因表达矩阵的p值和log FC对基因进行过滤,差异基因的筛选条件为|log FC|≥1且p＜0.05,应用DAVID网站对差异基因进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）信号通路分析;使用GSEA v3.0软件进行转录组GSEA（Gene Set Enrichment Analysis）分析。22.统计学分析利用Flowjo v10.3软件（BD）对流式细胞仪结果进行作图和相关分析。使用Graph Pad Prism v8.0.2软件对实验结果进行统计学分析并作图。两组之间的相关性采用Spearman检验。两组之间的比较采用Mann Whitney U检验。两组之间配对数据采用Wilcoxon配对检验,p＜0.05（双尾）认为有统计学意义,统计图中数据表示为Mean±SD,*代表p＜0.05,**代表p＜0.01,***代表p＜0.001。结果:一、老龄HIV感染者NK细胞代谢特征研究1.老龄HIV感染者NK细胞IFN-γ分泌水平降低IL-12/IL-15/IL-18刺激NK细胞,发现老龄HIV感染者NK细胞IFN-γ分泌水平降低,与年轻感染者和健康对照相比,老龄HIV感染者NK细胞功能受损严重。老龄化和HIV感染是影响NK细胞杀伤功能的重要因素。2.老龄HIV感染者NK细胞高表达免疫调控受体TIGIT和PD-1通过流式技术分析老龄HIV感染者NK细胞表面PD-1、Lag-3、Tim-3、CD84、TIGIT、CD161和2B4在内的7种免疫调控受体的表达水平,发现老龄HIV感染者NK细胞表面免疫调控受体TIGIT和PD-1表达水平显著升高。3.老龄HIV感染者NK细胞营养物质转运体的表达水平变化老龄HIV感染者NK细胞糖代谢营养物质转运体Glut-1表达水平降低且2-NBDG平均荧光强度降低,老龄感染者NK细胞糖代谢功能严重受损;老龄HIV感染者NK细胞脂肪酸转运蛋白CD36表达水平显著升高,且感染者NK细胞CD36表达水平与患者年龄呈正相关,与患者CD4+T绝对值计数呈负相关;老龄HIV感染者NK细胞氨基酸转运体CD98和转铁蛋白CD71表达水平未见改变。4.老龄HIV感染者NK细胞线粒体功能受损与健康人群相比,老龄HIV感染者NK细胞线粒体质量和膜电位水平均降低。5.细胞能量代谢仪检测老龄HIV感染者NK细胞代谢水平老龄HIV感染者NK细胞ECAR水平低于年轻感染者,与Glut-1和2-NBDG的结果一致;与HIV感染因素相比,老龄对HIV感染者NK细胞氧化磷酸化水平并无影响。6.抑制多种代谢途径影响HIV感染者NK细胞分泌IFN-γ的功能当抑制糖代谢后,HIV感染者NK细胞分泌IFN-γ能力下降,下降趋势与反应体系中糖代谢抑制剂2-DG的工作浓度呈剂量依赖关系,且抑制感染者糖酵解相关m TOR信号通路时,NK细胞功能也受损;当感染者NK细胞的脂肪酸代谢受抑制时,NK细胞功能无变化;当感染者NK细胞的氨基酸代谢被抑制时,其分泌IFN-γ的水平明显降低;当HIV感染者NK细胞的氧化磷酸化被抑制时,其分泌IFN-γ的水平均明显降低。二、HIV感染加速NK细胞衰老进程及代谢对衰老影响的研究1.HIV感染者NK细胞表面高表达多种细胞衰老标志物与健康对照相比,HIV感染者NK细胞高表达细胞衰老标志物（p16、p53、SA-β-gal、mito ROS和CD57）,但两组之间γH2AX水平无明显差异。2.体外感染HIV-1 env/gag蛋白促进NK细胞衰老首次发现体外加入HIV-1结构蛋白env和gag处理NK细胞,NK细胞表达细胞衰老标志物p16和p53的水平显著升高,但处理组和对照组p21表达水平并无差异。3.HIV感染者NK细胞衰老状况与HIV疾病载量呈正相关、与CD4+T细胞绝对值呈负相关HIV感染者NK细胞衰老标志物p53与p16表达水平与HIV病毒载量呈正相关,且感染者NK细胞SA-β-gal表达水平与患者CD4+T细胞绝对值计数呈负相关。4.HIV感染者NK细胞衰老状况与其IFN-γ、Granzyme B和Perforin分泌水平呈相关性HIV感染者NK细胞SA-β-gal表达水平与细胞IFN-γ分泌水平呈负相关;NK细胞p16表达水平与细胞Granzyme B分泌水平呈负相关;NK细胞p53表达水平与细胞Perforin水平呈负相关;CD57+NK细胞IFN-γ分泌水平显著低于CD57-NK细胞。5.HIV感染者血浆衰老相关分泌表型（Senescence-associated secretory phenotype,SASP）增加,营造NK衰老微环境在感染HIV后,患者血浆中CTACK、HGF、IL-2Ra、TNF-b、MIG、IFN-γ、IL-16、IL-18、MIF、SCGF-b、IL-9和MCP-1水平升高,且升高的细胞因子中CTACK、HGF、IL-2R、MIG、IFN-γ、IL-16、IL-18、MIF、SCGF-b和MCP-1水平与感染者年龄呈正相关。6.抑制细胞氧化磷酸化延缓NK细胞衰老进程体外分别抑制HIV感染者氧化磷酸化、糖代谢、脂代谢和氨基酸代谢,发现只有当抑制细胞氧化磷酸化时,HIV感染者NK细胞衰老指标SA-β-gal表达水平显著降低。三、二甲双胍通过代谢调控NK细胞衰老及相关机制的研究1.二甲双胍抑制HIV阴性健康人NK细胞衰老二甲双胍处理后,不管是否使用IL-12/IL-15/IL-18联合刺激NK细胞,健康人NK细胞SA-β-gal表达水平均显著低于对照组;体外加入二甲双胍后,未经细胞因子刺激的NK细胞p16表达水平显著低于对照组。2.二甲双胍抑制HIV感染者NK细胞衰老加入二甲双胍后,不管是否使用IL-12/IL-15/IL-18联合刺激NK细胞,感染者NK细胞的SA-β-gal表达水平均显著低于对照组;细胞刺激后,体外加入二甲双胍共培养的NK细胞p16表达水平显著降低;与对照组相比,未经刺激的实验组NK细胞p53表达水平显著降低。3.二甲双胍处理后NK细胞转录组水平改变转录组分析发现,二甲双胍激活NK细胞AMPK信号通路,且二甲双胍能缓解衰老相关疾病如阿兹海默症、中枢神经系统肿瘤和消化道肿瘤等。4.二甲双胍抑制NK细胞氧化磷酸化水平通过细胞能量代谢仪,发现二甲双胍处理后,能显著抑制NK细胞氧化磷酸化水平,同时NK细胞基础呼吸和最大呼吸均显著降低;此外二甲双胍能减少感染者NK细胞线粒体ROS的产生。5.二甲双胍促进NK细胞摄糖率二甲双胍能增强HIV感染者NK摄糖能力,但并不能增加NK细胞基础糖酵解和糖酵解容量。6.二甲双胍促进NK细胞存活,但不影响细胞因子分泌和增殖功能二甲双胍能够抑制HIV感染者NK细胞的晚期凋亡,促进NK细胞高表达Bcl-2,但不影响NK细胞IFN-γ、TNF-α、Granzyme B和Perforin的分泌能力,也不影响HIV感染者NK细胞Ki-67的表达水平。7.二甲双胍通过抑制Erk和NF-κB信号通路进而逆转NK细胞衰老二甲双胍通过抑制AMPK下游Erk和NF-κB信号,进而抑制NK细胞线粒体氧化磷酸化和ROS的产生水平,以实现其对NK细胞的抗衰作用。结论:1.相比年轻感染者,老龄HIV感染者NK细胞功能显著下降;感染者NK细胞功能均低于健康对照者,在老龄和HIV感染双重影响下,老龄HIV感染者NK细胞功能受损最严重。2.与年轻感染者相比,老龄HIV感染者NK细胞代谢特征发生改变,其NK细胞表面多种营养物质转运体表达水平发生变化,老龄HIV感染者NK细胞糖酵解能力明显受损,且抑制糖代谢,严重损伤NK细胞功能;与年轻感染者相比,老龄HIV感染者NK细胞氧化磷酸化能力未见明显改变,HIV感染是影响NK细胞氧化磷酸化能力的重要原因,进一步抑制HIV感染者氧化磷酸化能力,NK细胞功能受损;尽管感染者NK细胞氨基酸代谢转运体没有变化,但抑制HIV感染者氨基酸代谢,NK细胞功能同样受损;老龄HIV感染者高表达脂肪酸代谢转运体,但抑制HIV感染者脂肪酸代谢,NK细胞功能未见损伤。3.HIV感染后,促使NK细胞发生衰老,这种衰老情况在患者接受ART治疗后仍无法纠正。体外加入HIV-1结构蛋白同样可加剧NK细胞的衰老进程;HIV感染者NK细胞衰老状况与疾病进展和细胞功能密切相关。血浆微环境中升高的SASP构成了NK细胞衰老微环境,促进了NK细胞衰老。4.二甲双胍通过抑制Erk和NF-κB信号通路,抑制NK细胞氧化磷酸化水平,降低线粒体ROS产生,促进NK细胞存活能力,进而延缓HIV感染者NK细胞衰老进程。