目的构建髓系细胞触发受体1(TREM-1)基因重组慢病毒RNA(vshRNA)载体,通过抑制TREM-1的表达,进一步探讨TREM-1对脆弱杆菌脓毒症小鼠促炎因子表达及生存率的影响,以及TREM-1对NF-κB通路的相互影响。方法(1)以脆弱类杆菌对小鼠行腹腔注射造成脆弱杆菌脓毒症小鼠模型。收集肝组织提取总RNA或总蛋白,半定量RT-PCR法检测TREM-1 mRNA的表达,Western blot法检测TREM-1蛋白的表达,并用ELISA法检测血浆中TNF-α、IL-1β与IL-6的含量。(2)根据小鼠TREM-1的mRNA序列选择4个靶序列并设计合成4对双链DNA oligo,同时合成1对阴性对照双链DNA oligo;将以上5对双链DNA oligo退火后连入pGCSIL-GFP载体,PCR和测序鉴定后,将以上质粒分别和包装质粒混合物共转染293T细胞,包装产生病毒颗粒。各组病毒载体转染Raw264.7细胞后,实时定量PCR、ELISA观察干扰TREM-1后脆弱杆菌内毒素引发的Raw264.7细胞内毒素血症模型中TREM-1的表达变化。(3)建立脆弱杆菌小鼠脓毒症模型并运用TREM-1 vshRNA进行整体转染,观察TREM-1 vshRNA对TREM-1的抑制情况,并检测相关炎症因子在组织及血浆中的表达。将15只小鼠随机按数字表法分为5组(每组3只),即正常对照组和阳性对照组、TREM-1干扰组、TREM-1半量干扰组、绿色荧光蛋白(GFP)干扰组。按组分别经尾静脉注射等渗盐水、TREM-1 vshRNA 2×10~8TU、TREM-1 vshRNA 1×10~8TU、GFP vshRNA;1 h后,后4组小鼠同前制成脓毒症模型,正常对照组腹腔注射等体积等渗盐水。12 h后处死5组小鼠(每组3只),检测肝组织及血浆TNF-α、IL-1β和IL-6含量;取肝脾组织标本检测TREM-1mRNA及其蛋白的表达水平,以及肝内IκBα、pDAP12和核内NF-κBp65的蛋白表达情况的变化。。(4)对脆弱杆菌脓毒症小鼠尾静脉注射TREM-1 vshRNA后,观察小鼠的存活率。将清洁级BALB/c雄性小鼠225只按随机数字表法分为3组。第1组100只小鼠又随机分为阳性对照组、TREM-1干扰组、TREM-1半量干扰组、绿色荧光蛋白(GFP)干扰组,每组25只。第2组100只小鼠随机分为4组(每组25只),分别于腹腔注射脆弱杆菌后1、2、4、6 h尾静脉注射TREM-1vshRNA 2×10~8TU。第3组25只小鼠行尾静脉注射等渗盐水作为对照组。计算各组小鼠腹腔注射脆弱杆菌后72 h存活率。结果(1)在脆弱类杆菌刺激下,小鼠肝细胞中TREM-1表达水平上调呈时间依赖性,于12h达高峰;而脆弱类杆菌对TREM-1的诱导作用同时又呈剂量依赖性,同时伴有TNF-α、IL-1β及IL-6的表达增高,并分别与TREM-1蛋白表达水平呈正相关(rs=0.82,0.85,0.83及0.88,P＜0.01)。经实验确定,对小鼠行腹腔注射1.5×10~9 CFU/mL脆弱拟杆菌0.5 mL并刺激12 h后能够形成典型的脓毒症动物模型。(2)成功构建TREM-1基因重组慢病毒RNA(vshRNA)载体。各质粒与包装质粒共转染293T细胞后产生了高滴度的慢病毒颗粒;各组慢病毒感染Raw264.7细胞后都可以显著抑制TREM-1的表达,以第一组效果最明显。在脆弱杆菌内毒素引发的体外细胞内毒素血症模型中TREM-1表达明显增高,实时定量PCR表明TREM-1慢病毒干扰载体能显著抑制模型中TREM-1的表达。(3)TREM-1干扰组、TREM-1半量干扰组与阳性对照组的小鼠进行比较,血浆及肝组织TNF-α、IL-1β、IL-6表达均下降(P＜0.05),而GFP干扰组中TNF-α、IL-1β、IL-6表达与阳性对照组无明显差异(P＞0.05)。转染TREM-1 vshRNA后肝脾内TREM-1 mRNA及蛋白表达均有明显下调(P＜0.01)。TREM-1 vshRNA转染能明显下调脆弱类杆菌作用下脆弱杆菌脓毒症小鼠肝细胞中DAP12、核内NF-κB p65蛋白的表达并上调IκBα蛋白的表达水平,而GFP干扰组无类似效果。(4)脓毒症模型中,GFP干扰组和阳性对照组中小鼠在腹腔注射脆弱杆菌后72 h生存率均仅有16%。TREM-1干扰组及其半量干扰组生存率分别为76%和44%,明显高于GFP干扰组和阳性对照组(P＜0.05或P＜0.01)。另外两组脓毒症小鼠模型中,对照组及腹腔注射脆弱杆菌后1、2、4、6 h组再行尾静脉注射的72 h存活率分别为16%、72%、56%、40%、16%,其中1、2、4 h组明显高于对照组(P＜0.05或P＜0.01)。结论小鼠肝组织中TREM-1的表达水平在脆弱类杆菌的诱导下呈时间-剂量依赖性增高。成功构建了小鼠TREM-1基因RNAi慢病毒载体。证实所构建的慢病毒载体能够抑制脆弱类杆菌LPS所诱导的TREM-1的表达。运用尾静脉注射小鼠TREM-1基因RNAi慢病毒载体进行TREM-1干扰可有效降低脆弱杆菌脓毒症小鼠肝脾组织TREM-1表达水平,下调脆弱类杆菌诱导的促炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达,提高小鼠存活率,同时下调脆弱类杆菌作用下脓毒症小鼠肝细胞中DAP12、核内NF-κB p65的蛋白表达并上调IκBα蛋白的表达水平。而转染可能是通过下调DAP12的表达,稳定IκBα/NF-κB复合物,抑制TNF-α、IL-1β及IL-6的表达,而对脆弱类杆菌炎症反应产生抑制作用。第一章TREM-1在脆弱类杆菌小鼠脓毒症模型中的表达目的探讨在脆弱类杆菌所诱导的小鼠脓毒症炎症反应中肝细胞TREM-1的表达情况及其与促炎症因子分泌的关系。方法厌氧分离培养脆弱类杆菌临床株后,以脆弱类杆菌对小鼠行腹腔注射造成细菌性腹膜炎。收集肝组织提取总RNA或总蛋白,半定量RT-PCR法检测TREM-1 mRNA的表达,Western blot法检测TREM-1蛋白的表达,并用ELISA法检测血浆中TNF-α、IL-1β与IL-6的含量。结果在脆弱类杆菌刺激下,小鼠肝细胞中TREM-1表达水平明显上调,并呈时间依赖性,于12h达高峰;而不同浓度的脆弱类杆菌对TREM-1的诱导作用呈剂量依赖性,以2.5×10~9 CFU/mL浓度的诱导效应最明显;同时伴有TNF-α、IL-1β及IL-6的大量分泌,并分别与TREM-1蛋白表达水平呈正相关(rs=0.82,0.85,0.83及0.88,P＜0.01)。结论TREM-1表达水平在脆弱类杆菌的诱导下呈时间-剂量依赖性增高,TREM-1与促炎症因子分泌可能具有相关性。构建的脆弱类杆菌小鼠脓毒症模型为后续研究提供了实验平台。第二章髓系触发受体-1基因RNAi慢病毒载体的构建及功能初步检测目的构建TREM-1基因RNAi慢病毒载体,探讨TREM-1在脆弱类杆菌所致炎症反应中的作用。方法根据小鼠TREM-1的mRNA序列选择4个靶序列并设计合成4对双链DNA oligo,其两端含酶切位点粘端,同时合成1对阴性对照双链DNA oligo;将以上5对双链DNA oligo退火后连入pGCSIL-GFP载体,PCR和测序鉴定后,将以上质粒分别和包装质粒混合物共转染293T细胞,包装产生病毒颗粒。各组病毒载体转染Raw264.7细胞后,运用Real-Time PCR和ELISA检测TREM-1 mRNA和蛋白表达水平。实时定量PCR、ELISA观察干扰TREM-1后脆弱杆菌内毒素引发的Raw264.7细胞内毒素血症模型中TREM-1的表达变化。结果PCR和测序证实目的双链DNA oligo片段已被准确克隆到pGCSIL-GFP载体;各质粒与包装质粒共转染293T细胞后产生了高滴度的慢病毒颗粒;各组慢病毒感染Raw264.7细胞后都可以显著抑制TREM-1的表达,以第一组效果最明显。在脆弱杆菌内毒素引发的体外细胞内毒素血症模型中TREM-1表达明显增高,实时定量PCR表明慢病毒干扰载体能显著抑制模型中TREM-1的表达。结论成功构建了小鼠TREM-1基因RNAi慢病毒载体。证实所构建的慢病毒载体能够抑制脆弱类杆菌LPS所诱导的TREM-1的表达。第三章髓系细胞触发受体1慢病毒载体对脆弱拟杆菌脓毒症小鼠促炎因子表达的影响目的了解髓系细胞触发受体1(TREM-1)基因重组慢病毒短发夹RNA(vshRNA)载体对脆弱拟杆菌脓毒症小鼠促炎因子表达及生存率的影响。方法(1)构建TREM-1 vshRNA载体,经实验确定脓毒症小鼠模型制作条件:腹腔注射2.5×10~9 CFU/mL脆弱拟杆菌0.5 mL,刺激12 h。(2)15只小鼠按随机数字表法分为正常对照组和脓毒症模型组、TREM-1干扰组、TREM-1半量干扰组、绿色荧光蛋白(GFP)干扰组,每组3只。分别经尾静脉注射等渗盐水、TREM-1 vshRNA 2×10~8TU、TREM-1 vshRNA 1×10~8TU、GFP vshRNA;1 h后,后4组小鼠同前制成脓毒症模型,正常对照组注射等体积等渗盐水。12 h后处死5组小鼠(每组3只),取血检测血浆TNF-α、IL-1β和IL-6含量;取肝组织标本检测TREM-1 mRNA及其蛋白的表达水平。(3)将清洁级BALB/c雄性小鼠225只按随机数字表法分为3组。第1组100只小鼠随机分为脓毒症模型组、TREM-1干扰组、TREM-1半量干扰组、绿色荧光蛋白(GFP)干扰组,每组25只。第2组100只小鼠随机分为5组(每组25只),分别于腹腔注射后1、2、4、6 h尾静脉注射TREM-1 vshRNA 2×10~8TU。另25只尾静脉注射等渗盐水为对照组。计算腹腔注射后72h各组小鼠存活率。结果(1)与脓毒症模型组比较,TREM-1干扰组、TREM-1半量干扰组小鼠血浆TNF-α、IL-1β、IL-6含量均下降(P＜0.05),以TREM-1干扰组下降最明显。GFP干扰组中各促炎因子含量与脓毒症模型组接近(P＞0.05)。(2)与对照组比较,TREM-1干扰组及其半量干扰组小鼠肝组织TREM-1mRNA表达均明显下调(P＜0.01),以TREM-1干扰组尤为明显(P＜0.05)。TREM-1蛋白的表达与此一致。(3)脓毒症模型组、GFP干扰组小鼠腹腔注射后72 h后生存率均仅有16%。TREM-1干扰组及其半量干扰组生存率明显偏高,分别为76%和44%(P＜0.05或P＜0.01)。(4)对照组及腹腔注射后1、2、4、6 h组脓毒症小鼠模型其尾静脉注射后72 h存活率分别为16%、72%、56%、40%、16%,其中1、2、4 h组明显高于对照组(P＜0.05或P＜0.01)。结论运用TREM-1 vshRNA干扰技术,可以有效降低脆弱拟杆菌脓毒症小鼠肝组织TREM-1表达水平,抑制炎性因子TNF-α、IL-1β及IL-6的表达,提高小鼠存活率。第四章RNA干扰沉默TREM-1对脆弱类杆菌脓毒血症抑制作用的机制目的探讨小鼠TREM-1基因重组慢病毒干扰载体(Lentivector,LV)TREM-1vshRNA对脆弱杆菌脓毒血症小鼠脾脏中TREM-1及肝脏中促炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达以及NF-κB通路的影响。方法将清洁级BALB/c雄性小鼠100只分成4组,即正常对照组(C组),脆弱类杆菌脓毒症模型生理盐水组(S组),TREM-1vshRNA干扰实验组(T组)和GFPvshRNA干扰实验组(G组)。观察各组中小鼠脾内TREM-1及肝内TNF-α、IL-1β、1L-6、IκBα、pDAP12和核内NF-κB p65的蛋白表达情况的变化。结果与正常对照组相比较,S组和G组小鼠脾内TREM-1及肝内TNF-α、IL-1β、1L-6表达都明显上调,而与S组和G组相比较,T组脾内TREM-1 mRNA及蛋白表达均有明显下调(P＜0.01);肝细胞中TNF-α,IL-1β与IL-6的表达也明显降低(P＜0.01)。与脆弱类杆菌脓毒症模型生理盐水组相比较,TREM-1 vshRNA转染能明显下调脆弱类杆菌作用下肝细胞中DAP12、核内NF-κB p65蛋白的表达并上调IκBα蛋白的表达水平。结论小鼠TREM-1vshRNA可选择性抑制TREM-1表达,下调脆弱类杆菌诱导的促炎症因子的分泌,而转染可能是通过下调pDAP12的表达,稳定IκBα/NF-κB复合物,抑制TNF-α、IL-1β及IL-6的表达,而对脆弱类杆菌炎症反应产生抑制作用。