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目的:Bmal1(Arntl)是生物钟的核心时钟因子,其可参与重要生理行为或生命过程的调控。CYP3A4(小鼠Cyp3a11)是细胞色素P450酶系的重要成员,在药物的代谢和解毒过程中发挥重要作用。小鼠Cyp3a11表达呈现明显的节律性。然而,Bmal1是否对小鼠Cyp3a11具有调控作用,目前尚不明确。因此,本论文旨在探究Bmal1对Cyp3a11的调控作用,阐明Bmal1对Cyp3a11介导的药物代谢的调控效应和对药物时辰毒性的影响。方法:1.采用PCR-凝胶电泳技术,对小鼠基因型进行鉴定。采用实时荧光定量和蛋白质免疫印迹技术,检测野生型与Bmal1敲除鼠,Cyp3a11及其相关转录因子在六个昼夜时点(ZT2、ZT6、ZT10、ZT14、ZT18和ZT22)的表达。此外,采用微粒体孵育实验,进行Cyp3a11活性分析。2.以鼠源肝/肠癌细胞为模型,进行Bmal1高表达和siRNA敲除实验。利用实时荧光定量法和蛋白免疫印迹法,考察Bmal1对Cyp3a11及其相关转录因子的影响。采用荧光素酶报告基因、凝胶迁移以及染色质免疫沉淀实验阐明Bmal1对Cyp3a11调控机制。3.采用体外酶孵育实验,筛选乌头碱和雷公藤甲素的主要代谢酶。以野生型与Bmal1敲除鼠为实验对象,分析心脏毒性指标(肌酸激酶和丙二醛)和肝脏毒性指标(谷丙转氨酶和谷草转氨酶),评价乌头碱和雷公藤甲素的时辰毒性。通过肝微粒体孵育实验,考察小鼠肝脏对乌头碱和雷公藤代谢能力的昼夜差异。结果:1.Bmal1敲除使Cyp3a11失去节律。Cyp3a11表达具有节律性。Bmal1敲除抑制Cyp3a11的表达,并导致其昼夜节律紊乱。此外,Bmal1敲除使Cyp3a11酶活性显著下降。在细胞中敲除Bmal1,Cyp3a11表达降低。2.Bmal1间接调节Cyp3a11表达。Bmal1增强Cyp3a11的启动子活性。此外,Cyp3a11启动子上320 bp(-220 bp~+100 bp)序列是Bmal1调控Cyp3a11的关键区域。启动子序列分析表明,在此区间无E-box(Bmal1作用位点)存在。此结果表明Bmal1间接调控Cyp3a11的表达。我们进一步发现,在动物和细胞模型中,Bmal1敲除降低Dbp和Hnf4α(Cyp3a11调控因子)表达。此外,在-220bp~+100 bp区间中,存在Dbp和Hnf4α的结合位点(D-box序列和DR1序列)。敲低Hnf4α和Dbp,或突变D-box和DR1,Bmal1对Cyp3a11的调控效应消失。3.Bmal1调控Hnf4α。Bmal1结合Hnf4αP1启动子远端(-6100~-5900 bp)E-box位点,激活Hnf4α表达。4.Bmal1调节乌头碱和雷公藤甲素的时辰毒性。Cyp3a11是乌头碱和雷公藤甲素的主要代谢酶。乌头碱和雷公藤甲素的毒性具有时辰依赖性。在野生型小鼠中,ZT2毒性相比于ZT14较高。然而在Bmal1敲除鼠中,乌头碱和雷公藤甲素的毒性增加,但是其毒性在ZT2和ZT14并没有明显差异。野生型小鼠中,乌头碱和雷公藤甲素在ZT2的代谢能力高于ZT14。在Bmal1敲除鼠中,两个时间点的代谢能力没有差异。结论:1.Bmal1调节Cyp3a11的节律性表达;2.Bmal1在转录水平调控Dbp和Hnf4α的表达,间接调节Cyp3a11;3.乌头碱和雷公藤甲素具有时辰毒性;4.Bmal1影响乌头碱和雷公藤甲素的时辰毒性。