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研究背景及目的肿瘤的生长、侵袭、转移均依赖于血管生成，抗肿瘤血管生成具有良好的应用前景。血管内皮细胞生长因子VEGF为最主要的血管生成促进因子，它通过与胞膜上的VEGF受体（VEGFR）特异结合而发挥促血管生成作用，其中VEGFR-1（Flt-l）及VEGFR-2（KDR）高表达于肿瘤细胞及新生的血管内皮细胞，在其它细胞中极低表达或不表达，在肿瘤血管生成中处于核心地位，与肿瘤的生长与转移密切相关，阻断VEGFR的功能可抑制VEGF的促血管生成作用。因此，以VEGF/VEGFR为靶点开展的抗肿瘤血管生成研究成为当前的研究热点之一。VEGF125-136为VEGF-A外显子6编码的12肽QKRKRKKSRYKS，能与VEGFR特异结合但不激活VEGFR，对VEGFR起封闭作用，从而竞争抑制VEGF的促血管生成，有望作为肿瘤核素靶向显像或核素治疗的侯选分子。上一国家自然科学基金课题（30400114）结果提示：①188Re-VEGF125-136明显靶向聚集于荷瘤裸鼠的肿瘤组织，抑制肿瘤生长；②肿瘤组织转染截短KDR基因后，明显增加了188Re-VEGF125-136在肿瘤部位的聚集量。即该标记物在肿瘤的靶向显像及治疗方面具有较好的应用前景，但它在肿瘤组织的滞留时间仅3小时。进一步提高标记物在肿瘤组织的聚积量（提高瘤/非瘤比值）与滞留时间，以增强抗肿瘤作用为本研究需要深入探讨的重点。提高多肽与受体间的亲和力是提高标记物在肿瘤组织聚积量与滞留时间的有效途径。配体与受体结合的可逆性是受体的最基本特性之一，而亲和力是衡量配体-受体结合能力及稳定性的重要参数：亲和力越高，配体与受体越易结合，结合之后的复合物越稳定，不易发生解离。本研究旨在探讨VEGF125-136的改造及筛选目标多肽的方法，然后对目标多肽的99Tcm标记方法探讨，标记多肽在荷瘤裸鼠的体内分布及SPECT肿瘤靶向显像，为进一步的肿瘤靶向显像及靶向治疗奠定实验基础。研究方法1.多肽VEGF125-136的生物信息学改造：结合分子对接法及表面基团相互作用法对VEGF125-136进行改造，获得理论上与VEGFR间具有更高亲和力的多肽。2.体外受体竞争结合实验验证多肽与VEGFR的亲和力，3H-TdR参入实验验证多肽对肿瘤细胞增殖的影响，从上述多条多肽中筛选得到目标多肽。3.目标多肽的放射性核素标记及鉴定：选用合适的双功能螯合剂偶联多肽，探讨目标多肽的最佳标记条件，纸层析法和HPLC法鉴定多肽的标记率、放射化学纯度及体外稳定性。半胱氨酸置换实验验证99Tcm与多肽的螯合能力。体外受体竞争结合实验鉴定标记多肽的体外受体结合活性。4.标记多肽的药代动力学研究：取日本大耳兔8只，每只经左耳缘静脉注射1mCi/200μl标记多肽，分别于注射后1.5、3、5、10、30、60、120、240、480min从右耳缘静脉抽血测量血样放射性浓度，应用药物代谢动力学分析软件（DAS3.0）分析多肽最佳方式模型及示踪动力学参数。5.标记多肽在正常昆明小鼠体内分布研究：15只昆明小鼠经尾静脉注射标记溶液7.4MBq/200μl，分别于30min、1h、2h摘眼球法收集血液并将小鼠颈椎脱臼法处死，收集心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、肠、甲状腺、骨、肌肉，分别称重并测放射性，经参考源校正后计算每克组织百分注射剂量率（%ID/g）。6.日本大耳白兔显像研究：耳缘静脉注射标记溶液0.5mCi后立即以1帧/min采集60min，并于90、120、180、240min预置计时5min采集图像一帧，观察各器官的放射性分布动态变化。7.标记多肽在荷瘤裸鼠体内显像及竞争抑制显像研究：荷瘤裸鼠注射标记目标多肽物（11.1MBq/只）后0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h行SPECT平面预置计时（10min）显像。注射目标多肽1mg后注射标记目标多肽物（11.1MBq/只），0.5h、1h行SPECT平面预置计时（10min）显像，评价目标多肽与肿瘤组织结合的特异性。实验结果1.生物信息学方法改造VEGF125-136并经体外实验验证获得了两条与VEGFR受体亲和力高且可以明显抑制肿瘤细胞增殖的多肽： QKRKRKKSRKKH、RKRKRKKSRYIVLS。2.目标多肽的放射性核素标记及鉴定：目标多肽选用HYNIC为双功能螯合剂，标记方法如下：在2ml细胞冻存管中依次加入20μg多肽，HYNIC-QKRKRKKSRKKH50mg Tricine，HYNIC-RKRKRKKSRYIVLS为80mgTricine，5mg TPPTS，100μL0.25mmol/L琥珀酸缓冲溶液（pH=5），100μL Na99TcmO4185MBq，总体积200μL，充氮密封后100℃反应25min，自然冷却至室温。经双功能螯合剂HYNIC偶联后的多肽QKRKRKKSRKKH、RKRKRKKSRYIVLS，标记率均>（94.13±1.77）。室温下放置24h后，放化纯度仍高达90%。两条多肽经HYNIC修饰后抑制肿瘤细胞增殖能力与修饰前无明显差异。两条多肽经HYNIC修饰并经99Tcm标记后仍保持了良好的受体结合活性，能与靶细胞特异结合。3.99Tcm-HYNIC-QKRKRKKSRKKH在正常日本大耳兔体内的药物代谢动力学过程符合三室模型。99Tcm-HYNIC-RKRKRKKSRYIVLS在正常日本大耳兔体内的药物代谢动力学过程符合二室模型。4.正常昆明小鼠体内分布及日本大耳白兔体内显像示：两条多肽具有亲水性，主要通过肾脏经泌尿系统排泄，血流清除快，在心、肝、脾、肺、脑、胃肠、甲状腺、骨、肌肉等组织器官中分布较少。5.荷瘤裸鼠体内显像示：尾静脉注射标记多肽后0.5h，肿瘤部位即可见明显放射性浓聚，双肾、膀胱可见明显的放射性浓聚，而心脏、肺脏、肝脏、胃肠道、脑、颈部及肌肉组织均未见明显放射性分布。竞争抑制显像肿瘤部位未见明显放射性浓聚。结论生物信息学方法有望为分子探针或靶向药物的开发提供重要支撑，通过该技术筛选得到了2条基于VEGFR的高亲和力肿瘤靶向抑制肽，并对其成功地进行了放射性核素99Tcm标记，为其进一步作为分子探针或靶向药物用于肿瘤的分子显像及靶向治疗奠定了一定的实验基础。