【摘 要】
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果胶裂解酶(Pectate lyase,PL)是具有调节细胞壁弹性和通透性作用的重要果胶修饰酶,参与果胶降解相关的生理过程,在植物的多种生长发育过程中发挥重要作用。枣果实品质的重要指标之一为果实质地,研究果胶裂解酶基因家族中基因在具有质地差异的果实中的表达模式及调控机制,对枣果实品质的改善提供理论指导。本研究基于‘冬枣’和‘骏枣’基因组,鉴定枣基因组中的果胶裂解酶基因;利用生物信息学软件,分析枣果
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果胶裂解酶(Pectate lyase,PL)是具有调节细胞壁弹性和通透性作用的重要果胶修饰酶,参与果胶降解相关的生理过程,在植物的多种生长发育过程中发挥重要作用。枣果实品质的重要指标之一为果实质地,研究果胶裂解酶基因家族中基因在具有质地差异的果实中的表达模式及调控机制,对枣果实品质的改善提供理论指导。本研究基于‘冬枣’和‘骏枣’基因组,鉴定枣基因组中的果胶裂解酶基因;利用生物信息学软件,分析枣果胶裂解酶基因家族成员的基因结构特征;基于RNA-Seq数据,分析该家族基因在根、茎、枝、叶、花和半红期果实的不同组织及存在质地差异的不同品种果实发育过程中的表达模式;对筛选出的与果实质地密切相关的候选基因,利用基因工程技术选择酸枣和烟草两种试验材料进行试验,进而验证基因功能。结果如下:(1)基于‘冬枣’基因组,鉴定出13个枣果胶裂解酶基因,然后借助‘骏枣’基因组校正以上基因,增加ZjPL10新成员,最终共鉴定出14个枣果胶裂解酶基因,它们不均匀分布在8条染色体上。构建进化树将枣果胶裂解酶家族基因划分为5个亚家族(Group I-Group V),每个亚家族中的基因共享保守的基因结构和基序组成。发现了ZjPLs启动子区的顺式作用元件与生长发育和应激反应相关。同源性分析表明‘冬枣’与番茄的亲缘关系较拟南芥更近。以上研究揭示了枣果胶裂解酶家族基因的结构特征及进化等信息,为深入研究ZjPLs的功能奠定理论基础。(2)通过对枣果胶裂解酶基因家族成员在‘冬枣’的根、茎、枝、叶、花和半红期果实组织中的转录组数据进行分析,发现多数ZjPLs基因在花和果实这两种组织中表达量最高,因此推测ZjPLs基因可能在枣的生殖和果实发育过程起重要作用。(3)通过分析该家族基因在存在质地和大小差异的果实发育过程各阶段中的表达模式,研究发现ZjPL07基因在果实中可能是呈现先升高,花后35d和45d的果实中表达量达到表达量峰值,然后随果实发育逐渐降低的表达趋势。ZjPL07基因在不同质地果实中的表达模式有显著差异,在‘P15’(硬质),‘骏枣’(制干)及‘中阳木枣’(小果型)果实中表达量较高,其中在‘P15’(硬质),‘骏枣’(制干)中表达量明显高于‘冬枣’。ZjPL07基因在‘冬枣’果肉和果皮中各时期的表达趋势相同,ZjPL07基因在‘P15’的果肉和果皮中各时期表达趋势不同,因此推测ZjPL07基因在‘P15’果实发育过程中对果皮和果肉作用差异很大。说明ZjPL07基因在‘冬枣’与‘P15’果肉、果皮中的表达强度和变化趋势存在差异。进一步说明ZjPL07基因与果实质地性状存在密切关系,可能调控果实质地。综上确定ZjPL07基因为调控枣果实质地的候选基因。(4)使用遗传关联分析方法探究ZjPL07基因和果实质地之间的关联情况。研究发现ZjPL07基因位于Chr5的22735399bp和22736020bp位置处的碱基差异会导致相应氨基酸和蛋白质的差异,最终导致SNP位点处的纯合基因型果皮的破裂强度,果皮韧性,果皮硬度显著高于杂合基因型果实(P<0.05),即产生了性状上的差异。影响了果皮的软硬程度,从而在基因与性状关联分析的角度说明ZjPL07基因对于果实质地起到调控作用。(5)本试验成功构建了ZjPL07基因的过表达载体p RI101::ZjPL07,对酸枣和烟草进行遗传转化试验,将获得的烟草抗性植株通过DNA水平上的验证,初步筛选获得5株转基因烟草阳性植株。转基因烟草阳性植株的荧光定量试验检测结果显示,转基因烟草阳性植株的表达量均显著高于野生型烟草植株。验证ZjPL07基因功能,结果显示过表达ZjPL07基因的line2和line4烟草株系比野生型植株中的果胶裂解酶活性高,原果胶含量低,并且均具有显著性。
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