鲤鱼MyD88基因的分子克隆及功能的初步研究

来源 :山东师范大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:qvwen2005
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天然免疫是机体防御微生物病原体入侵第一道防线,机体细胞通过表达不同的模式识别受体(PRRs),来识别包括类脂,脂蛋白,蛋白和核酸在内的各种病原相关分子模式(PAMPs),激活机体细胞内信号通路,诱导炎症细胞因子和趋化因子及干扰素的表达。Toll样受体(TLRs)家族是参与识别病原体相关分子模式(PAMPs)的模式识别受体(PRRs)之一,在天然免疫系统中起着非常重要的作用,并且能够激活适应性免疫,是联系天然免疫和适应性免疫的桥梁。髓样分化因子88(MyD88)是白介素Ⅰ受体/Toll样受体超家族胞内信号通路中重要的接头分子,介导除TLR3外的TLRs信号通路。血清淀粉样A (Serum amyloid A , SAA)是TLR信号通路所诱导炎症反应的效应分子,是一种主要的急性期蛋白。炎性刺激诱导炎症反应发生时,细胞因子促进SAA高度表达。本研究以鲤鱼为研究对象,采用分子克隆和SMART RACE技术获得鲤鱼MyD88 cDNA全长。根据已得到的cDNA序列,设计跨ORF引物,以DNA为模板,获得MyD88基因全长。MyD88 cDNA序列全长1728bp,包含3’非翻译区870bp,858bp的开放阅读框。MyD88基因全长3748bp,包含5个外显子,4个内含子。用生物信息学方法对该序列进行结构和进化分析,MyD88基因序列的分析表明,鲤鱼MyD88基因编码的蛋白质由284个氨基酸组成,其分子量为32.86kDa、pI为5.79。利用在线软件SMART程序对推导的氨基酸序列分析其功能结构域,结果表明,该蛋白具有典型的MyD88结构,N端具有死亡结构域,中间的连接结构域和C末端的TIR结构域。同源分析表明,鲤鱼MyD88蛋白氨基酸序列也具有高度的保守性,其中TIR区相似性比ORF和Death区都高,这与TIR区的高度保守性有关。氨基酸结构分析、多序列比对和进化树分析都表明,MyD88与其他物种MyD88之间有较高的氨基酸相似性,与斑马鱼MyD88(NM212814)、牙鲆MyD88(AB241074)、人MyD88(NM002468)、小鼠MyD88(AAC53013)的相似性分别是86.0%、66.9%、60.4%以及59.6%。对RNA进行定量分析后,用M-MLV逆转录酶进行反转录获得cDNA第一链,进行半定量RT-PCR,检测鲤鱼MyD88在不同组织中的表达量,结果显示MyD88基因在健康鲤鱼的所选组织中均有所表达,其中在前肠、脾脏、头肾、口腔上皮和性腺中表达量较高,后肠和肌肉组织中表达量稍低。采用鳗弧菌浸泡免疫鲤鱼0d、6h、1d、3d、5d,Real-time PCR检测表明MyD88基因和SAA基因mRNA表达水平在头肾、前肠、后肠和脾脏组织中均呈现一定规律的变化,在免疫诱导后表达量先升高后下调,整体趋势符合机体受刺激后MyD88和SAA的产生规律,揭示MyD88和SAA参与机体的天然免疫应答,在机体的免疫防御中发挥着重要的作用。
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